研究背景和目的：肾上腺髓质素(ADM)作为一种舒血管的肽类物质，最初从人的肾上腺髓质肿瘤组织中提取出来。随后的研究提示，ADM不仅能够调节血管张力，还能够以自分泌或旁分泌的方式影响细胞的增殖与分化。ADM一直以来被认为是一个多功能肽，而其作用特点具有细胞类型的差异性。在3T3细胞系中，ADM以剂量依赖方式增加DNA的合成，可能的机制是ADM特异性受体参与或是增加了cAMP／PKA。对于人的血管平滑肌细胞和胶质细胞，ADM抑制其细胞增殖并增加细胞内cAMP水平。ADM也能抑制培养的正常人胶质细胞、胶质瘤细胞及胶质瘤源性细胞系的增殖。但是，Moody等人报道ADM对培养的C6胶质瘤细胞有促有丝分裂的作用，并且这一作用与细胞内cAMP的增加相关。为阐明ADM的确切机制，其主要问题在于细胞表面的信号是如何传递到细胞内部，从而发生基因表达，完成细胞对外环境的反应过程。目前已有一些研究显示了ADM产生的细胞传递信号机制。cAMP作为第二信使是ADM作用过程中的主要因子。然而，ADM的作用并不能被cAMP激活剂forskolin所完全代替，提示ADM具有第二信使以外的作用方式。 ADM可以在各种不同类型的组织和细胞中表达，血管内皮细胞(VECs)是最重要的一种。在包括人在内的血管细胞中，ADM是腺苷酸环化酶非常有效的激活剂，其作用强于降钙素基因相关肽(CGRP)。这些研究结果证明，ADM在血管细胞功能的生理与病理调节上起了重要作用。 VECs在心血管疾病中扮演了关键性角色。VECs的凋亡、损伤及增殖与各种相关疾病的发展紧密结合，如冠心病、高血压、心力衰竭等等。一些可以显著增加细胞内cAMP的因子也是VECs增殖的抑制剂。近期研究表明，ADM以剂量依赖方式抑制血小板源性生长因子(PDGF)及胎牛血清(FCS)刺激的人的脐静脉内皮细胞增殖。以往的研究证实这样的观点，ADM与和VECs相关的心脏疾病的病理生理相联系。但少有资料显示ADM对兔血管内 第四军医大学博士学位论文 皮细胞的信号转导机制的作用。ADM对VECS作用的生理药理学 机制仍不清楚。 本文研究了ADM对有或无血清刺激的兔VECS增殖的影响； 是否ADM对VECs的作用通过了两个独立的途径，即cAMP的聚 集和细胞内钙动员改变；本文还观察了ADM是否激活了核转录因 子＊F。B的表达：AD M对＊＊乙的的凋亡作用是怎样的；最后， 还探讨了ADM及受体在原代培养的兔血管内皮细胞上的表达情况 及是否细菌脂多糖（LPS）上调ADM及受体的表达。 方法：1．用DMEM培养液进行原代兔VECS培养，细胞透射电镜 鉴定后用于实验研究。‘H－TdR掺入法测定 ADM（10－’义 10－ ’mol几）对10％FCS及PDGF－BB门）刺激的VECs及去血 情24 ／J’时静止的VECs生长的作用。2将培养的细胞置于PBS （含有或不含有 ADM）15分钟，酶免疫法测定细胞内 cAMP及 CGMP 为测定 ADM对细胞内游离钙的作用，用n。－3荧光标记 细胞，给予ADM（1”’l0“’mOI几）刺激后用激光共聚焦显微镜测 定细胞内游离钙。3．给予LPS门／ml）或ADM刺激细胞30分钟 后，NF kappa B发生的核转移由荧光免疫染色确定；细胞浆内 NF k叩pa B蛋白由 Western blot＊迹法狈得；4．使用 T’UNEL标记及 DNA电泳法判定去血清24小时诱导的凋亡及与ADM共培养时细 胞凋亡的发生情况。5．ADM 及 ADMR 在有或无 LPS LPS （ n。ml）刺激的表达用原位杂交的方法观察。 结果：1．和对照组相比，ADM以剂量依赖性方式抑制PDGF七B 门’ml）刺激的 VECs的增殖，对血请刺激及静止的 VECs增 殖无作用c最大抑制作用在浓度10”’mol几处，且与对照组比差异 明显（P＜0刀1）。2．ADM能够增加细胞内CAMP水平及降低细胞内 cGMP水平，这一作用呈剂量依赖性门”‘’刁“’mol几），最大作 用见于 10“’mol／L；ADM降低细胞内游离［CaZ＋］，且有剂量依赖性 （1”‘刁0”’m＊几）；用NO合酶抑制剂卜NAME门 ＊）预先处 理VECS，可以桔抗ADM降钙的作用。3．在未被刺激的VECS 中，＊Fk叩paB的表达只定位在细胞浆：当＊＊乙暴露于＊PS或 ADM3 0分钟后，NF kappa B较强的染色可在胞核观察到，而未被 刺激的细胞只有较弱的荧光显示。4．ADM能够抑制去血清诱导的 VECs凋亡，与对照组相比，最大作用见于 10”moffe。c删P增高 剂可以提高细胞内。AMP水平，但对ADM抑制细胞存活的作用 无影响；但 L－NAME门“M）能够模拟 ADM的提高细胞存活率 3