论文部分内容阅读
研究背景
抑郁症是一种常见的以显著而持久的心境低落为主要特点的精神类疾病，它严重困扰着人们日常的工作、学习和生活，也给社会造成不小的负担和不稳定因素。在抑郁症的中医证型中，肝郁脾虚证最为常见。肝郁脾虚证的主要有肝郁所致的与情绪相关的症状和脾虚所致的胃肠功能的紊乱和物质能量代谢失常的症状。其中，肝郁的病机与中枢神经内分泌免疫网络有关，而物质能量代谢则与脾虚的病理表现息息相关。
本课题组多年研究发现，肝郁脾虚证的物质能量代谢失调主要表现为糖代谢紊乱，可其中枢机制目前尚未完全清楚。研究发现，自噬参与了肝郁脾虚证的能量代谢过程，葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter member 4, GLUT4)是机体摄取外周葡萄糖的主要调节蛋白，能在下丘脑神经元中发挥维持机体葡萄糖稳态的作用。RasGTPase超家族中的成员Rab8和Rab10可共同调控自噬的成熟及GLUT4囊泡的运输，在自噬参与调控GLUT4转位中起到重要衔接作用。
研究发现逍遥散能改善CUMS引起的抑郁样行为，但逍遥散能否调节下丘脑神经元自噬，并通过调节GLUT4的水平进一步影响肝郁脾虚证葡萄糖代谢尚不明确。故从自噬和葡萄糖代谢相关指标——GLUT4切入，有助于深入了解肝郁脾虚证的现代发病机制，为逍遥散治疗抑郁症提供新的科学依据。
研究目的
通过慢性不可预知温和应激(CUMS)建立肝郁脾虚证抑郁小鼠模型，并设立自噬阻断为对照，通过运用行为学检测、透射电镜、免疫荧光、蛋白免疫印迹、RT-qPCR等现代技术，探讨肝郁脾虚证抑郁小鼠下丘脑神经元自噬的改变及其对葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的影响，并探讨在这个过程中，逍遥散对其的调控作用，以期为肝郁脾虚证的生物学基础研究和逍遥散的抗抑郁作用提供新的科学依据。
研究方法
本实验主要可分为两大部分：
1.选用SPF级C57BL/6J雄性小鼠60只，6-8周龄，体重18-25g左右，适应喂养7d，称重。剔除过于活跃和过于安静小鼠(根据旷场实验)，以及体重增长缓慢和过快的小鼠，进行编号，并按体重随机分为正常、CUMS模型、逍遥散和氟西汀4组，每组15只，分3笼喂养。正常组小鼠自由进食进水，无应激。CUMS模型、逍遥散和氟西汀3组均接受为期6周的连续不可预知温和应激造模和不同的药物灌胃给药。从应激的第4周开始进行灌胃给药，正常组和CUMS模型组灌胃去离子水，逍遥散组和氟西汀组分别灌胃逍遥散和氟西汀进行干预。观察并记录小鼠的一般情况(宏观表征、体重和摄食量)，并通过旷场实验、悬尾实验和糖水偏好实验等行为学实验对模型进行评价。后面采用腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)检测小鼠血糖，用ELISA法检测小鼠血清胰岛素水平的改变，用透射电镜(TEM)观察小鼠下丘脑自噬的变化，再采用免疫荧光、WesternBlot、RT-qPCR等生物学手段检测肝郁脾虚证抑郁小鼠下丘脑自噬相关指标LC3、p62和葡萄糖代谢相关指标GLUT4、Rab8、Rab10蛋白和基因的表达变化。
2.通过第一部分实验验证，得知肝郁脾虚证抑郁小鼠的自噬水平下降，葡萄糖代谢紊乱，为了进一步研究自噬在其中发挥的作用，在此基础之上，我们选用第二批C57BL/6J雄性小鼠80只，6-8周龄，体重18-25g左右，适应喂养7d，称重。剔除过于活跃和过于安静小鼠(根据旷场实验)，以及体重增长缓慢和过快的小鼠，进行编号，并按体重随机分为正常、假手术、手术组和逍遥散4组，每组20只，分4笼喂养。各组小鼠自由进食进水，无应激。假手术组小鼠将脑室注射生理盐水，手术组和逍遥散组小鼠将注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)。手术恢复后对正常组、假手术组和手术组小鼠灌胃去离子水，逍遥散组灌胃逍遥散进行干预。观察并记录小鼠的一般情况(宏观表征、体重和摄食量)，并通过旷场实验、强迫游泳实验和糖水偏好实验等行为学实验对各组尤其是手术组小鼠的焦虑和抑郁状况进行评价。后续其他检测方法同第一部分实验。
研究结果
1.第一部分实验结果
(1)模型评价结果：①一般情况：CUMS造模导致模型组小鼠逐渐出现精神状态差、蜷缩扎堆、倦怠懒动、毛发干枯杂乱、便溏等症状，且造模应激过程中反抗明显减弱，有的甚至无挣扎情况，在逍遥散进行干预后，精神状态逐渐好转、毛发渐有光泽，活动度和反应度增加，粪便成形。在体重上，各组小鼠开始成稳步增长趋势，从第3周末直到第6周，除正常组外，其他3组小鼠体重都有所下降，且与正常组比较具有统计学差异(P＜0.01或P＜0.05)，其他三组小鼠体重差异不大(P＞O.O5)。各组小鼠的每日摄食量虽起伏不定，但整体上模型组小鼠的摄食量少于其他三组，尚不存在统计学意义(P＞O.O5)。②行为学结果：各组小鼠旷场实验运动总距离结果显示，与正常组相比，模型组小鼠在旷场中的运动总距离减少(P＜0.05)，逍遥散组和氟西汀组的小鼠的运动总距离与模型组相比大大增加(P＜0.05或P＜0.01)；各组小鼠旷场实验中央区停留时间结果得知，模型组小鼠在旷场箱中央区停留的时间明显少于正常组(P＜0.01)，与模型组比较，逍遥散组和氟西汀组的小鼠在中央区停留的时间均有所增长(P＜0.05)。各组小鼠悬尾实验不动时间的结果显示，模型组小鼠的悬尾不动时间比正常组显著延长(P＜0.01)，逍遥散组和氟西汀组小鼠的不动时间减少比模型组短(P＜0.05或P＜0.01)。各组小鼠糖水偏好实验结果表明，6周的CUMS造模降低了模型组小鼠的糖水偏好率(P＜0.01)，逍遥散组和氟西汀组小鼠的糖水偏好率与模型组比明显增高(P＜0.01)。
(2)自噬水平的变化：①通过拍摄各个实验组下丘脑透射电镜图，我们发现跟正常组相比，模型组的下丘脑自噬小体数量明显降低(P＜0.01)，逍遥散和氟西汀两个用药组自噬小体跟模型组相比明显增多(P＜0.01)。
②各组小鼠WB结果显示，在下丘脑LC3的蛋白表达中，模型组跟正常组比LC3水平下降，尤其是LC3Ⅱ下降比较明显，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的值低于正常组(P＜0.05)；在给模型组灌胃逍遥散和氟西汀之后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的值均有升高(P＜0.05或P＜O.O1)；在下丘脑p62的蛋白表达中，模型组的表达高于正常组(P＜0.05)，逍遥散和氟西汀降低了模型小鼠该蛋白的表达(P＜0.05)。③各组小鼠RT-qPCR结果表明，在下丘脑LC3的基因表达中，模型组比正常组LC3的水平要低(P＜0.05)，而逍遥散和氟西汀组比模型组表达要高(P＜0.05)；在下丘脑p62的基因表达中，模型组高于正常组(P＜0.05)，逍遥散组和氟西汀组低于模型组(P＜0.05)。
(3)GLUT4等葡萄糖代谢相关指标的变化：①就GLUT4免疫荧光结果来看，模型组小鼠下丘脑背内侧核和室旁核GLUT4的表达明显少于正常组小鼠(P＜0.01)，逍遥散组和氟西汀组小鼠下丘脑该核团GLUT4的表达比模型组均显著增高(P＜0.01)。②各组小鼠血清胰岛素结果显示，模型组与正常组比血清胰岛素水平显著下降(P＜0.01)，逍遥散组和氟西汀组比模型组有了显著升高(P＜0.01)。③通过对各组小鼠分别进行0、15、30、60、120min的血糖检测，各组小鼠IPGTT结果显示，模型组小鼠在各时间点的血糖值均高于正常组和两个治疗组，在60min时的血糖值跟逍遥散组比较具有显著差异(P＜0.01)，在120min时，比正常组、逍遥散和氟西汀组均明显升高(P＜0.01、P＜0.01或P＜0.05)。④WB结果表明，模型组GLUT4的表达比正常组低(P＜0.01)，逍遥散和氟西汀组比模型组高(P＜0.05)；在下丘脑Rab8和Rab10的蛋白表达中，模型组低于正常组(P＜0.05)，逍遥散组和氟西汀组均高于模型组(P＜0.05)。⑤各组小鼠RT-qPCR结果表明，在下丘脑GLUT4的基因表达中，模型组低于正常组(P＜0.05)，逍遥散和氟西汀组高于模型组(P＜0.05)；在下丘脑Rab8和Rab10的基因表达中，模型组的表达均低于正常组(P＜0.05)；逍遥散组和氟西汀组高于模型组(P＜0.01或P＜0.05)。
2.第二部分实验结果
(1)行为学评价结果：①一般情况：正常组、假手术组和逍遥散组小鼠精神状态良好，毛发光亮，对外界活动的反应度高，粪便干湿软硬适中；手术组小鼠与另外三组比，状态稍差，毛发光泽度下降，反应灵敏度较低，粪便基本正常。就小鼠体重而言，各组小鼠体重呈稳步上升的趋势，正常组小鼠体重最高，假手术组和逍遥散组小鼠体重比较接近，手术组小鼠体重略低于其他三组，但无明显差异(P＞0.05)。各组小鼠不同时间点摄食量结果显示，手术组小鼠的摄食量始终处于最低水平，其他三组之间摄食量的差异不明显(P＞O.O5)。②行为学结果：各组小鼠旷场实验运动总距离结果表明，手术组小鼠的运动总距离显著低于正常组(P＜0.01)，假手术组小鼠与正常组比无明显变化(P＞0.05)，假手术组和逍遥散组小鼠的运动总距离比手术组明显增多(P＜0.01)；各组小鼠旷场实验中央区停留时间结果显示，手术小鼠在旷场箱中央区停留的时间跟正常组比大大缩短(P＜0.01)，而假手术组与正常组之间不存在明显差异(P＞0.05)，假手术组和逍遥散组比手术组明显增加(P＜0.01，P＜0.05)。悬尾实验不动时间的结果显示，跟正常组比较，手术组小鼠在悬尾实验过程中的不动时间显著延长(P＜0.05)，假手术组与正常组之间无明显差异(P＞0.05)，假手术组和逍遥散组与手术组相比，小鼠不动时间明显要短(P＜0.05)。小鼠糖水偏好实验结果如下，手术组和假手术组小鼠的糖水偏好率明显低于正常组(P＜0.01)，假手术组与正常组差异不大(P＞0.05)，逍遥散组的糖水偏好率与手术组比明显增高(P＜0.01)。
(2)自噬水平的变化：①通过拍摄各个实验组下丘脑透射电镜图，我们发现手术组的自噬小体数量比正常组和假手术组明显要少(P＜0.01)，假手术组跟正常组比无明显差别(p＞0.05)，而逍遥散组下丘脑自噬小体数量比手术组明显增多(P＜0.01)。②通过WB结果，我们得知在下丘脑LC3的蛋白表达中，手术组跟正常组和假手术组比，LC3Ⅱ的表达明显降低，p62的表达则有所升高(P＜0.05)；而假手术组和正常组之间均无明显差异(P＞0.05)，在灌胃逍遥散之后，LC3Ⅱ的表达明显上升，而p62的表达则明显下降(P＜0.05)。③观察RT-qPCR结果可知，在下丘脑LC3的基因表达中，手术组LC3的水平比正常组有所下降(P＜0.05)，假手术组略有升高，但不具有统计学意义(P＞0.05)，跟手术组比，逍遥散组LC3的表达升高(P＜0.05)。在下丘脑p62的基因表达中，手术组明显高于正常组和假手术组(P＜0.01)，假手术组和正常组间无差异(P＞0.05)，逍遥散组跟手术组相比水平下降(P＜0.05)。
(3)GLUT4等葡萄糖代谢相关指标的变化：①各组小鼠GLUT4免疫荧光结果如下，正常组小鼠下丘脑背内侧核和室旁核GLUT4的表达明显多于手术组小鼠(P＜0.01)；假手术组小鼠下丘脑背内侧核GLUT4的表达明显多于手术组(P＜0.01)；假手术组与正常组比室旁核表达较少，背内侧核表达无明显差异(P＞0.05)；跟手术组相比，逍遥散组小鼠下丘脑背内侧核和室旁核GLUT4的表达显著增多(P＜0.01)。②就血清胰岛素结果看，手术组与正常组和假手术组相比，血清胰岛素水平显著下降(P＜0.01)，假手术组和正常组之间无差异(P＞0.05)，逍遥散组跟手术组相比，血清胰岛素水平有了显著升高(P＜0.01)。③IPGTT结果显示，手术组小鼠在各时间点的血糖值均高于其他三组，手术组小鼠的血糖值在15、30、60min时均明显高于正常组和假手术组(P＜0.01)，逍遥散组小鼠的血糖值在15和60min时明显低于手术组(P＜0.05)。④从WB结果看，在下丘脑GLUT4的蛋白表达中，手术组跟正常组和假手术组比明显下降(P＜0.01或P＜0.05)，假手术组和正常组比无明显差别(P＞0.05)，逍遥散组比手术组明显上升(P＜0.05)。在下丘脑Rab8和Rab10的蛋白表达中，跟正常组比，手术组的表达均明显降低(P＜0.01)；跟假手术组比，手术组的表达也降低了，Rab8的降低幅度大于Rab10(P＜0.01或P＜0.05)；假手术组与正常组相比均无差异(P＞0.05)；逍遥散组小鼠下丘脑这两个蛋白的表达均高于手术组(P＜0.01或P＜0.05)。⑤在下丘脑GLUT4的基因表达当中，手术组比正常组和假手术组明显要低(P＜0.05)，假手术组跟正常组无明显差异(P＞0.05)，逍遥散组明显高于手术组的表达水平(P＜0.05)。在下丘脑Rab8和Rab10的表达中，手术组明显低于正常组(P＜0.05)，同时低于假手术组，但Rab8的表达无较大差异(P＞0.05)，Rab10的表达差异有统计意义(P＜0.05)；假手术组与正常组之间两个基因的表达均无显著区别(P＞0.05)；逍遥散组Rab8和Rab10的表达比手术组均有提升(P＜0.05或P＜0.01)。
研究结论
1.采用6周CUMS构建肝郁脾虚证抑郁小鼠模型，通过观察动物宏观表征和进行行为学测试，并用逍遥散的调节作用以方测证，对此模型进行评价，最终成功构建了抑郁症肝郁脾虚证动物模型。
2.依据透射电镜、WB、RT-qPCR等实验结果，可知肝郁脾虚证模型小鼠下丘脑自噬水平下发生改变，而逍遥散对其具有调节作用。
3.根据小鼠血清胰岛素和空腹血糖值，以及WB和RT-qPCR的实验结果，结合自噬水平的改变，提示下丘脑神经元自噬介导Rab8和Rab10改变GLUT4的表达，影响葡萄糖代谢。
4.通过脑室注射自噬抑制剂，正向与反向验证了逍遥散通过调节下丘脑神经元自噬介导GLUT4的表达，从而影响肝郁脾虚证葡萄糖代谢的治疗作用。
抑郁症是一种常见的以显著而持久的心境低落为主要特点的精神类疾病，它严重困扰着人们日常的工作、学习和生活，也给社会造成不小的负担和不稳定因素。在抑郁症的中医证型中，肝郁脾虚证最为常见。肝郁脾虚证的主要有肝郁所致的与情绪相关的症状和脾虚所致的胃肠功能的紊乱和物质能量代谢失常的症状。其中，肝郁的病机与中枢神经内分泌免疫网络有关，而物质能量代谢则与脾虚的病理表现息息相关。
本课题组多年研究发现，肝郁脾虚证的物质能量代谢失调主要表现为糖代谢紊乱，可其中枢机制目前尚未完全清楚。研究发现，自噬参与了肝郁脾虚证的能量代谢过程，葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter member 4, GLUT4)是机体摄取外周葡萄糖的主要调节蛋白，能在下丘脑神经元中发挥维持机体葡萄糖稳态的作用。RasGTPase超家族中的成员Rab8和Rab10可共同调控自噬的成熟及GLUT4囊泡的运输，在自噬参与调控GLUT4转位中起到重要衔接作用。
研究发现逍遥散能改善CUMS引起的抑郁样行为，但逍遥散能否调节下丘脑神经元自噬，并通过调节GLUT4的水平进一步影响肝郁脾虚证葡萄糖代谢尚不明确。故从自噬和葡萄糖代谢相关指标——GLUT4切入，有助于深入了解肝郁脾虚证的现代发病机制，为逍遥散治疗抑郁症提供新的科学依据。
研究目的
通过慢性不可预知温和应激(CUMS)建立肝郁脾虚证抑郁小鼠模型，并设立自噬阻断为对照，通过运用行为学检测、透射电镜、免疫荧光、蛋白免疫印迹、RT-qPCR等现代技术，探讨肝郁脾虚证抑郁小鼠下丘脑神经元自噬的改变及其对葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的影响，并探讨在这个过程中，逍遥散对其的调控作用，以期为肝郁脾虚证的生物学基础研究和逍遥散的抗抑郁作用提供新的科学依据。
研究方法
本实验主要可分为两大部分：
1.选用SPF级C57BL/6J雄性小鼠60只，6-8周龄，体重18-25g左右，适应喂养7d，称重。剔除过于活跃和过于安静小鼠(根据旷场实验)，以及体重增长缓慢和过快的小鼠，进行编号，并按体重随机分为正常、CUMS模型、逍遥散和氟西汀4组，每组15只，分3笼喂养。正常组小鼠自由进食进水，无应激。CUMS模型、逍遥散和氟西汀3组均接受为期6周的连续不可预知温和应激造模和不同的药物灌胃给药。从应激的第4周开始进行灌胃给药，正常组和CUMS模型组灌胃去离子水，逍遥散组和氟西汀组分别灌胃逍遥散和氟西汀进行干预。观察并记录小鼠的一般情况(宏观表征、体重和摄食量)，并通过旷场实验、悬尾实验和糖水偏好实验等行为学实验对模型进行评价。后面采用腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)检测小鼠血糖，用ELISA法检测小鼠血清胰岛素水平的改变，用透射电镜(TEM)观察小鼠下丘脑自噬的变化，再采用免疫荧光、WesternBlot、RT-qPCR等生物学手段检测肝郁脾虚证抑郁小鼠下丘脑自噬相关指标LC3、p62和葡萄糖代谢相关指标GLUT4、Rab8、Rab10蛋白和基因的表达变化。
2.通过第一部分实验验证，得知肝郁脾虚证抑郁小鼠的自噬水平下降，葡萄糖代谢紊乱，为了进一步研究自噬在其中发挥的作用，在此基础之上，我们选用第二批C57BL/6J雄性小鼠80只，6-8周龄，体重18-25g左右，适应喂养7d，称重。剔除过于活跃和过于安静小鼠(根据旷场实验)，以及体重增长缓慢和过快的小鼠，进行编号，并按体重随机分为正常、假手术、手术组和逍遥散4组，每组20只，分4笼喂养。各组小鼠自由进食进水，无应激。假手术组小鼠将脑室注射生理盐水，手术组和逍遥散组小鼠将注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)。手术恢复后对正常组、假手术组和手术组小鼠灌胃去离子水，逍遥散组灌胃逍遥散进行干预。观察并记录小鼠的一般情况(宏观表征、体重和摄食量)，并通过旷场实验、强迫游泳实验和糖水偏好实验等行为学实验对各组尤其是手术组小鼠的焦虑和抑郁状况进行评价。后续其他检测方法同第一部分实验。
研究结果
1.第一部分实验结果
(1)模型评价结果：①一般情况：CUMS造模导致模型组小鼠逐渐出现精神状态差、蜷缩扎堆、倦怠懒动、毛发干枯杂乱、便溏等症状，且造模应激过程中反抗明显减弱，有的甚至无挣扎情况，在逍遥散进行干预后，精神状态逐渐好转、毛发渐有光泽，活动度和反应度增加，粪便成形。在体重上，各组小鼠开始成稳步增长趋势，从第3周末直到第6周，除正常组外，其他3组小鼠体重都有所下降，且与正常组比较具有统计学差异(P＜0.01或P＜0.05)，其他三组小鼠体重差异不大(P＞O.O5)。各组小鼠的每日摄食量虽起伏不定，但整体上模型组小鼠的摄食量少于其他三组，尚不存在统计学意义(P＞O.O5)。②行为学结果：各组小鼠旷场实验运动总距离结果显示，与正常组相比，模型组小鼠在旷场中的运动总距离减少(P＜0.05)，逍遥散组和氟西汀组的小鼠的运动总距离与模型组相比大大增加(P＜0.05或P＜0.01)；各组小鼠旷场实验中央区停留时间结果得知，模型组小鼠在旷场箱中央区停留的时间明显少于正常组(P＜0.01)，与模型组比较，逍遥散组和氟西汀组的小鼠在中央区停留的时间均有所增长(P＜0.05)。各组小鼠悬尾实验不动时间的结果显示，模型组小鼠的悬尾不动时间比正常组显著延长(P＜0.01)，逍遥散组和氟西汀组小鼠的不动时间减少比模型组短(P＜0.05或P＜0.01)。各组小鼠糖水偏好实验结果表明，6周的CUMS造模降低了模型组小鼠的糖水偏好率(P＜0.01)，逍遥散组和氟西汀组小鼠的糖水偏好率与模型组比明显增高(P＜0.01)。
(2)自噬水平的变化：①通过拍摄各个实验组下丘脑透射电镜图，我们发现跟正常组相比，模型组的下丘脑自噬小体数量明显降低(P＜0.01)，逍遥散和氟西汀两个用药组自噬小体跟模型组相比明显增多(P＜0.01)。
②各组小鼠WB结果显示，在下丘脑LC3的蛋白表达中，模型组跟正常组比LC3水平下降，尤其是LC3Ⅱ下降比较明显，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的值低于正常组(P＜0.05)；在给模型组灌胃逍遥散和氟西汀之后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的值均有升高(P＜0.05或P＜O.O1)；在下丘脑p62的蛋白表达中，模型组的表达高于正常组(P＜0.05)，逍遥散和氟西汀降低了模型小鼠该蛋白的表达(P＜0.05)。③各组小鼠RT-qPCR结果表明，在下丘脑LC3的基因表达中，模型组比正常组LC3的水平要低(P＜0.05)，而逍遥散和氟西汀组比模型组表达要高(P＜0.05)；在下丘脑p62的基因表达中，模型组高于正常组(P＜0.05)，逍遥散组和氟西汀组低于模型组(P＜0.05)。
(3)GLUT4等葡萄糖代谢相关指标的变化：①就GLUT4免疫荧光结果来看，模型组小鼠下丘脑背内侧核和室旁核GLUT4的表达明显少于正常组小鼠(P＜0.01)，逍遥散组和氟西汀组小鼠下丘脑该核团GLUT4的表达比模型组均显著增高(P＜0.01)。②各组小鼠血清胰岛素结果显示，模型组与正常组比血清胰岛素水平显著下降(P＜0.01)，逍遥散组和氟西汀组比模型组有了显著升高(P＜0.01)。③通过对各组小鼠分别进行0、15、30、60、120min的血糖检测，各组小鼠IPGTT结果显示，模型组小鼠在各时间点的血糖值均高于正常组和两个治疗组，在60min时的血糖值跟逍遥散组比较具有显著差异(P＜0.01)，在120min时，比正常组、逍遥散和氟西汀组均明显升高(P＜0.01、P＜0.01或P＜0.05)。④WB结果表明，模型组GLUT4的表达比正常组低(P＜0.01)，逍遥散和氟西汀组比模型组高(P＜0.05)；在下丘脑Rab8和Rab10的蛋白表达中，模型组低于正常组(P＜0.05)，逍遥散组和氟西汀组均高于模型组(P＜0.05)。⑤各组小鼠RT-qPCR结果表明，在下丘脑GLUT4的基因表达中，模型组低于正常组(P＜0.05)，逍遥散和氟西汀组高于模型组(P＜0.05)；在下丘脑Rab8和Rab10的基因表达中，模型组的表达均低于正常组(P＜0.05)；逍遥散组和氟西汀组高于模型组(P＜0.01或P＜0.05)。
2.第二部分实验结果
(1)行为学评价结果：①一般情况：正常组、假手术组和逍遥散组小鼠精神状态良好，毛发光亮，对外界活动的反应度高，粪便干湿软硬适中；手术组小鼠与另外三组比，状态稍差，毛发光泽度下降，反应灵敏度较低，粪便基本正常。就小鼠体重而言，各组小鼠体重呈稳步上升的趋势，正常组小鼠体重最高，假手术组和逍遥散组小鼠体重比较接近，手术组小鼠体重略低于其他三组，但无明显差异(P＞0.05)。各组小鼠不同时间点摄食量结果显示，手术组小鼠的摄食量始终处于最低水平，其他三组之间摄食量的差异不明显(P＞O.O5)。②行为学结果：各组小鼠旷场实验运动总距离结果表明，手术组小鼠的运动总距离显著低于正常组(P＜0.01)，假手术组小鼠与正常组比无明显变化(P＞0.05)，假手术组和逍遥散组小鼠的运动总距离比手术组明显增多(P＜0.01)；各组小鼠旷场实验中央区停留时间结果显示，手术小鼠在旷场箱中央区停留的时间跟正常组比大大缩短(P＜0.01)，而假手术组与正常组之间不存在明显差异(P＞0.05)，假手术组和逍遥散组比手术组明显增加(P＜0.01，P＜0.05)。悬尾实验不动时间的结果显示，跟正常组比较，手术组小鼠在悬尾实验过程中的不动时间显著延长(P＜0.05)，假手术组与正常组之间无明显差异(P＞0.05)，假手术组和逍遥散组与手术组相比，小鼠不动时间明显要短(P＜0.05)。小鼠糖水偏好实验结果如下，手术组和假手术组小鼠的糖水偏好率明显低于正常组(P＜0.01)，假手术组与正常组差异不大(P＞0.05)，逍遥散组的糖水偏好率与手术组比明显增高(P＜0.01)。
(2)自噬水平的变化：①通过拍摄各个实验组下丘脑透射电镜图，我们发现手术组的自噬小体数量比正常组和假手术组明显要少(P＜0.01)，假手术组跟正常组比无明显差别(p＞0.05)，而逍遥散组下丘脑自噬小体数量比手术组明显增多(P＜0.01)。②通过WB结果，我们得知在下丘脑LC3的蛋白表达中，手术组跟正常组和假手术组比，LC3Ⅱ的表达明显降低，p62的表达则有所升高(P＜0.05)；而假手术组和正常组之间均无明显差异(P＞0.05)，在灌胃逍遥散之后，LC3Ⅱ的表达明显上升，而p62的表达则明显下降(P＜0.05)。③观察RT-qPCR结果可知，在下丘脑LC3的基因表达中，手术组LC3的水平比正常组有所下降(P＜0.05)，假手术组略有升高，但不具有统计学意义(P＞0.05)，跟手术组比，逍遥散组LC3的表达升高(P＜0.05)。在下丘脑p62的基因表达中，手术组明显高于正常组和假手术组(P＜0.01)，假手术组和正常组间无差异(P＞0.05)，逍遥散组跟手术组相比水平下降(P＜0.05)。
(3)GLUT4等葡萄糖代谢相关指标的变化：①各组小鼠GLUT4免疫荧光结果如下，正常组小鼠下丘脑背内侧核和室旁核GLUT4的表达明显多于手术组小鼠(P＜0.01)；假手术组小鼠下丘脑背内侧核GLUT4的表达明显多于手术组(P＜0.01)；假手术组与正常组比室旁核表达较少，背内侧核表达无明显差异(P＞0.05)；跟手术组相比，逍遥散组小鼠下丘脑背内侧核和室旁核GLUT4的表达显著增多(P＜0.01)。②就血清胰岛素结果看，手术组与正常组和假手术组相比，血清胰岛素水平显著下降(P＜0.01)，假手术组和正常组之间无差异(P＞0.05)，逍遥散组跟手术组相比，血清胰岛素水平有了显著升高(P＜0.01)。③IPGTT结果显示，手术组小鼠在各时间点的血糖值均高于其他三组，手术组小鼠的血糖值在15、30、60min时均明显高于正常组和假手术组(P＜0.01)，逍遥散组小鼠的血糖值在15和60min时明显低于手术组(P＜0.05)。④从WB结果看，在下丘脑GLUT4的蛋白表达中，手术组跟正常组和假手术组比明显下降(P＜0.01或P＜0.05)，假手术组和正常组比无明显差别(P＞0.05)，逍遥散组比手术组明显上升(P＜0.05)。在下丘脑Rab8和Rab10的蛋白表达中，跟正常组比，手术组的表达均明显降低(P＜0.01)；跟假手术组比，手术组的表达也降低了，Rab8的降低幅度大于Rab10(P＜0.01或P＜0.05)；假手术组与正常组相比均无差异(P＞0.05)；逍遥散组小鼠下丘脑这两个蛋白的表达均高于手术组(P＜0.01或P＜0.05)。⑤在下丘脑GLUT4的基因表达当中，手术组比正常组和假手术组明显要低(P＜0.05)，假手术组跟正常组无明显差异(P＞0.05)，逍遥散组明显高于手术组的表达水平(P＜0.05)。在下丘脑Rab8和Rab10的表达中，手术组明显低于正常组(P＜0.05)，同时低于假手术组，但Rab8的表达无较大差异(P＞0.05)，Rab10的表达差异有统计意义(P＜0.05)；假手术组与正常组之间两个基因的表达均无显著区别(P＞0.05)；逍遥散组Rab8和Rab10的表达比手术组均有提升(P＜0.05或P＜0.01)。
研究结论
1.采用6周CUMS构建肝郁脾虚证抑郁小鼠模型，通过观察动物宏观表征和进行行为学测试，并用逍遥散的调节作用以方测证，对此模型进行评价，最终成功构建了抑郁症肝郁脾虚证动物模型。
2.依据透射电镜、WB、RT-qPCR等实验结果，可知肝郁脾虚证模型小鼠下丘脑自噬水平下发生改变，而逍遥散对其具有调节作用。
3.根据小鼠血清胰岛素和空腹血糖值，以及WB和RT-qPCR的实验结果，结合自噬水平的改变，提示下丘脑神经元自噬介导Rab8和Rab10改变GLUT4的表达，影响葡萄糖代谢。
4.通过脑室注射自噬抑制剂，正向与反向验证了逍遥散通过调节下丘脑神经元自噬介导GLUT4的表达，从而影响肝郁脾虚证葡萄糖代谢的治疗作用。