第一部分:γδT细胞对皮肤移植免疫排斥反应的影响和机制研究研究背景:γδT细胞是除αβT细胞以外的另一群T细胞,在外周循环和淋巴器官中比例很小,但在皮肤中比例却较高。以小鼠为例,γδT细胞占皮肤表皮中T细胞比例的90%以上,占真皮中T细胞比例的一半。Vγ1、Vγ4和Vγ5T细胞是小鼠皮肤中驻扎的主要γδT细胞亚群,各自具有不同的生物学功能。Vγ5T细胞仅分布在表皮组织中,称表皮树突状T淋巴细胞（DETC）,可分泌IGF-1、KGF等细胞因子维持皮肤稳态和促进创面愈合。Vγ1和Vγ4 T细胞不仅分布于外周循环,也分布于皮肤的真皮层,可分泌IL-17A和IFN-γ参与皮肤自身免疫疾病、抗肿瘤免疫和感染免疫。然而,Vγ1和Vγ4 T细胞对皮肤移植排斥的作用尚不清楚。IL-17A是一强大的促炎细胞因子,可招募中性粒细胞和巨噬细胞,在炎症级联反应的起始阶段发挥重要作用。IL-17A主要来源于Th17细胞和γδT细胞。γδT细胞是天然免疫细胞,其激活不需要抗原递呈细胞呈递信号,文献报道γδT细胞可在机体损伤后3h即分泌IL-17A;而Th17是适应性免疫细胞,需要抗原递呈细胞提高活化信号,其活化时间较长,一般在1周后表达IL-17A;因此,γδT细胞被认为在免疫反应早期（0-7天）分泌IL-17A,Th17发挥作用在其之后（7天之后）。在心脏同种异体排斥反应和自身免疫疾病中,γδT细胞分泌IL-17A发挥重要作用,但其在皮肤排斥反应中的作用尚不清楚。此外,γδT细胞的亚群Vγ4 T细胞与Th17细胞有些共同特征,如均表达IL-23受体、CCR6和RORγ。在炎症反应中,Th17细胞被招募至炎症部位,分泌大量的IL-17A以放大局部炎症反应。CCL20可招募CCR6⁺Th17细胞迁移至炎症部位。然而γδT细胞迁移至皮肤移植部位是否也依赖趋化因子-趋化因子受体CCL20-CCR6通路仍不清楚。此外IL-1β和IL-23可刺激γδT细胞产生IL-17A,对于炎症反应的启动和放大非常重要。因此,我们需要探究IL-1β和IL-23是否参与γδT细胞介导的皮肤移植排斥反应。文献报道皮肤移植排斥反应主要由宿主同种异体反应性αβT细胞驱动,此外同种异体移植物的排斥导致的炎症反应强烈地诱发了局部的树突状细胞（dendritic cell,DC）成熟,然后转移到外周的引流淋巴结以激活特定抗原特异性αβT细胞。然而,γδT细胞来源的IL-17A是否促进成熟的DC在引流淋巴结（DLN）的聚集,以及对αβT细胞效应功能的调节需要进一步阐明。我们对Vγ1 T细胞或/和Vγ4 T细胞在皮肤移植排斥反应中的作用进行了研究,主要包含一下四个问题:1、Vγ1 T细胞或/和Vγ4 T细胞是否参与排斥反应及在排斥反应的哪个阶段发挥作用?2、此类γδT细胞如何参与调控排斥反应?3、IL-1β和IL-23是否影响此类γδT细胞表达IL-17A?4、此类γδT细胞是否影响树突状细胞活化和迁移以调控αβT细胞?结果:1、Vγ4 T细胞参与排斥反应,其主要在急性排斥反应的早期发挥作用。我们将野生型小鼠皮肤移植至Tcrδ^-/-小鼠背部,发现移植皮片存活时间明显延长;然而将Tcrδ^-/-小鼠皮肤移植至野生型小鼠背部,移植皮片存活时间没有明显改变,提示宿主皮肤中而不是皮片中的γδT细胞参与皮肤移植排斥反应。将野生型小鼠的Vγ1T细胞或Vγ4 T细胞分别清除,或将Vγ1 T细胞、Vγ4 T细胞分别回输至Tcrδ^-/-小鼠移植创基,发现Vγ4 T细胞比Vγ1T细胞对移植排斥反应的促排作用更为显著。分别在移植前3天或移植后10天清除雌性WT移植宿主体内的Vγ4 T细胞,发现移植前清除Vγ4 T细胞比移植后清除延长皮片存活的效果更明显,提示Vγ4 T细胞主要在急性排斥反应的早期发挥作用。2、Vγ4 T细胞分泌IL-17促进皮肤排斥反应,以及依赖CCR6-CCL20通路浸润至表皮。2.1、Vγ4 T细胞分泌IL-17促进皮肤排斥反应。我们在移植皮片周缘注射IFN-γ或IL-17A的中和抗体,或野生雄鼠的皮片移植至同周龄的雌性Ifn-γ^-/-和Il-17a^-/-小鼠背部,发现IL-17A比IFN-γ对皮肤排斥反应的作用更为显著。将Ifn-γ^-/-和Il-17a^-/-Vγ4 T细胞分别回输至Tcrδ^-/-小鼠移植创基,发现Ifn-γ^-/-Vγ4 T细胞显著加速排斥反应发生,而Il-17a^-/-Vγ4 T细胞无明显效应。通过WB和免疫组化检测Vγ4 T细胞清除组与对照组移植皮片和移植周缘皮肤组织中的IL-17A的表达,结果显示Vγ4 T细胞清除组在移植皮片和移植周缘皮肤组织中的IL-17A的表达均减少。因此,我们认为IL-17A是Vγ4 T细胞促进皮肤排斥反应的主要介质。2.2、Vγ4 T细胞依赖CCR6-CCL20通路浸润至表皮。在移植后第三天收集移植皮片和移植周缘的表皮组织,检测出Vγ4 T细胞浸润表皮并且Vγ4 T细胞表达CCR6。此外,移植皮片和移植周缘表皮组织中CCL20表达明显增多。而将野生型小鼠移植皮片周缘的CCL20中和后,皮片存活时间显著延长,Vγ4T细胞数量和IL-17A的表达量急剧减少。以上结果说明移植术后Vγ4 T细胞通过CCR6-CCL20通路浸润至表皮。3、IL-1β和IL-23诱导表皮浸润的Vγ4 T细胞表达IL-17A。通过阻断移植宿主表达IL-1β和IL-23,我们发现移植皮片和移植周缘表皮组织中IL-17A的表达明显减少且移植排斥明显延迟。然而,清除Vγ4 T细胞后再中和IL-1β和IL-23,不能进一步延缓移植排斥反应。这些结果提示IL-1β和IL-23促进Vγ4 T细胞产生IL-17A加重移植排斥反应。4、Vγ4 T细胞产生的IL-17A促进树突状细胞聚集于引流淋巴结以活化αβT细胞。我们清除Vγ4 T细胞后,发现引流淋巴结中的MHCⅡ^highCD86⁺CD11c⁺DC和IL-17A⁺CD4⁺αβT细胞均明显减少。将WT或Il-17a^-/-Vγ4 T细胞回输至Tcrδ^-/-小鼠皮片移植区域,发现引流淋巴结中IL-17A敲除组的MHCⅡ^highCD86⁺CD11c⁺DC的数量和IL-17A⁺CD4⁺αβT细胞的数量均明显下降。这些结果提示Vγ4 T细胞在急性排斥反应早期产生的IL-17A可以增强将在后续排斥反应中发挥作用的CD4⁺αβT细胞表达IL-17A。综上所述,我们的研究发现Vγ4 T细胞在急性排斥反应早期通过CCR6-CCL20通路从真皮迁移至移植区域表皮,在IL-1β和IL-23诱导刺激下分泌大量的IL-17A,促进DC成熟及迁移至引流淋巴结,激活αβT细胞表达IL-17A。本研究拓展了γδT细胞在皮肤移植排斥反应中的认识,可能为今后人类皮肤移植排斥反应的机制研究及防治提供新的思路和线索。第二部分:γδT细胞对创面愈合的影响和机制研究研究背景:γδT细胞是皮肤免疫防御的重要组成部分,参与银屑病、肿瘤、皮肤移植排斥、微生物感染和创面愈合等疾病。DETC特异性且专一性地表达Vγ5Vδ1 TCR,仅分布在小鼠皮肤的表皮层。Vγ4 T细胞是小鼠外周循环中的主要γδT细胞亚群,分布于皮肤组织但仅存在于真皮层。皮肤损伤后创缘的DETC可快速活化分泌IGF-1,是表皮组织IGF-1的主要来源,促进创面修复。Vγ4 T细胞参与过敏反应、自身免疫疾病、抗肿瘤免疫和感染免疫。然而Vγ4 T细胞是否影响创面愈合尚不清楚。IL-17A是促炎细胞因子,在炎症反应的起始和发展中发挥着重要作用。γδT细胞是IL-17A在炎症反应的初始阶段的早期来源,而Th17细胞是IL-17A在炎症后期阶段的主要来源。文献报道IL-17A对有效的创面愈合是必须的,可诱导表皮角质形成细胞表达抗菌肽β-防御素3（β-defensin 3）和Reg IIIγ。然而,Rodero MP等人报道了与之相反的结果,即IL-17A可能抑制创面愈合。在皮肤移植模型中,我们发现Vγ4 T细胞可通过CCL20-CCR6通路从真皮迁移至表皮,是移植早期创缘组织IL-17A的主要来源。但Vγ4 T细胞和IL-17A对皮肤创面愈合的作用有待进一步阐述。皮肤中的IL-1β和IL-23主要来源于角质形成细胞和朗格汉斯细胞。在γδT细胞介导的皮肤疾病中,IL-1β和IL-23可强烈促进γδT细胞分泌IL-17A。我们发现IL-1β和IL-23可诱导Vγ4 T细胞加重皮肤移植排斥反应。有意思的是,移植区域的Vγ4 T细胞产生的IL-17A可反过来增强表皮组织中IL-1β和IL-23的表达。然而,在创面愈合中IL-1β/IL-23是否影响γδT细胞表达IL-17A,尚未研究清楚。表皮组织中DETC分泌的IGF-1可显著促进角质形成细胞增殖和迁移,对于及时有效的创面愈合至关重要。Vγ4 T细胞产生的IL-17A是否影响DETC表达IGF-1,继而在创面愈合发挥作用值得探究。在此基础上,我们对Vγ4 T细胞对创面愈合以及DETC促愈合作用的影响进行研究,主要包含以下几个方面:1、Vγ4 T细胞是否影响创面愈合以及DETC表达IGF-1?2、Vγ4 T细胞通过何种方式影响DETC对IGF-1的表达?3、Vγ4 T细胞影响DETC产生IGF-1的信号通路是什么?结果:1、Vγ4 T细胞通过抑制DETC分泌IGF-1延迟创面愈合。1.1、Vγ4 T细胞通过作用于DETC延迟创面愈合。我们分别清除野生型小鼠的Vγ4 T细胞和Vγ1 T细胞,发现Vγ4 T细胞清除后创面愈合明显加速,而Vγ1 T细胞清除后创面愈合没有明显改变,提示Vγ4 T细胞可延迟创面愈合。然而将Vγ4 T细胞回输至Tcrδ^-/-小鼠背部创面并不能促进创面愈合,提示Vγ4 T可能是间接影响创面愈合。文献报道DETC在创面愈合中发挥着重要的作用。将新鲜分离的DETC单独或者DETC与Vγ4 T细胞的混悬液回输至至Tcrδ^-/-小鼠的创基,后者与前者相比创面愈合延迟。这些结果提示Vγ4 T细胞可能是通过DETC延迟创面愈合。1.2、Vγ4 T细胞抑制DETC分泌IGF-1从而影响创面愈合。我们通过WB和免疫组化检测Vγ4T细胞清除鼠和对照鼠创周表皮中IGF-1的表达量,发现Vγ4T细胞清除后IGF-1表达明显提高。DETC回输至Tcrδ^-/-小鼠创面可显著提高创周表皮中IGF-1的产量,但是Vγ4 T细胞与DETC同时回输时IGF-1的表达量却不及DETC单独回输时增长的明显。Vγ4 T细胞清除小鼠创缘注射r IGF-1可促进创面愈合,而给予IGF-1中和抗体会延迟创面愈合。这些结果提示Vγ4 T细胞能够抑制DETC表达IGF-1影响创面修复。1.3、Vγ4 T细胞不影响DETC的数量和形态仅抑制DETC表达IGF-1。通过对Vγ4 T细胞清除鼠和对照鼠造创后创缘表皮中DETC的比例、数量和形态检测,发现Vγ4 T细胞清除后DETC的比例、数量和形态没有明显改变。分离Vγ4 T细胞清除小鼠和对照小鼠创周表皮中的DETC,检测其表面活化标志如CD25、CD44、CD62L及CD69,结果显示两组活化标志表达无显著差异,提示Vγ4 T细胞不能影响DETC活化标志的表达。而检测活化受体如Vγ5 TCR、NKG2D和JAML,发现Vγ4 T细胞清除后创缘表皮的DETC虽然JAML表达无明显改变,但Vγ5 TCR表达水平轻微增高,NKG2D表达水平显著提高。这些结果说明Vγ4 T细胞不影响DETC活化标志表达但可抑制活化受体表达。流式细胞术检测创缘Vγ4 T细胞清除鼠和对照鼠创缘DETC的IGF-1表达水平,结果显示Vγ4 T细胞清除后DETC的IGF-1表达量上升。这些结果提示Vγ4 T细胞对DETC的影响不在数量和活化标志而主要在于IGF-1的表达。2、Vγ4 T细胞分泌IL-17A并迁移至创缘表皮抑制创面愈合。2.1、Vγ4 T细胞依赖IL-17A抑制创面愈合。我们检测正常小鼠及Vγ4 T细胞清除小鼠创缘皮肤中IFN-γ和IL-17A的表达水平,发现皮肤损伤后IL-17A+Vγ4 T细胞明显增多,Vγ4 T细胞清除后IL-17A表达量明显下降;而IFN-γ无此类似改变。将Ifn-γ-/-小鼠、Il-17a-/-小鼠和Tcrδ^-/-小鼠造创,及行细胞回输实验进一步探究Vγ4 T细胞分泌何种细胞因子发挥作用,结果提示IL-17A而非IFN-γ是Vγ4 T细胞延迟创面愈合的主要细胞因子。此外,在Vγ4 T细胞清除后于创缘皮下注射r IL-17A可抑制创面愈合,而给予IL-17A中和抗体（20μg/创面）可显著促进创面愈合。这些结果提示Vγ4 T细胞依赖IL-17A抑制创面愈合。2.2、Vγ4 T细胞是皮肤损伤后表皮中IL-17A的主要早期来源,通过CCR6-CCL20从真皮迁移至表皮。通过检测皮肤损伤后创缘表皮、真皮及引流淋巴结中Vγ4 T细胞比例,我们发现皮肤损伤后Vγ4 T细胞比例在表皮明显上升,在真皮却下降,而引流淋巴结中无明显改变。检测创缘表皮中表达IL-17A的细胞亚群,发现超过50%的IL-17A+T细胞为Vγ4T细胞,仅少于5%的IL-17A+细胞为DETC。Vγ4 T细胞清除后表皮组织中IL-17A的表达量明显减少,而真皮中的IL-17A表达量无明显变化。将Vγ4 T细胞而不是DETC回输至Tcrδ^-/-小鼠的创基可显著增加创周表皮组织中IL-17A的产量,提示Vγ4 T细胞是表皮组织中IL-17A早期主要来源。流式细胞术检测发现基本全部浸润表皮的Vγ4 T细胞为CCR6阳性,而中和抗体阻断CCL20可显著下调浸润表皮的Vγ4 T细胞比例,说明皮肤损伤后Vγ4 T细胞浸润表皮依赖CCR6-CCL20途径。2.3、皮肤损伤后IL-17A能够抑制表皮组织中DETC对IGF-1的表达。将低、中、高3种不同剂量的r IL-17A分别注射至野生型小鼠创缘皮下,发现高剂量的r IL-17A（200ng/创面）明显阻碍创面愈合,而低剂量（2ng/创面）或中等剂量（20ng/创面）的r IL-17A却不能显现阻碍愈合的效应。IL-17A的中和抗体注射于创缘皮下均显著增加了表皮组织中的IGF-1的表达量和DETC中IGF-1的阳性比例,而r IL-17A注射至创缘皮下明显降低了表皮组织中IGF-1的产量和IGF-1阳性的DETC比例,改变程度与中和抗体、细胞因子剂量大小呈现正相关。3、IL-1β和IL-23是Vγ4 T细胞抑制DETC分泌IGF-1的中介。3.1、IL-1β和IL-23直接抑制DETC产生IGF-1延迟创面愈合。在体外将DETC与从新生鼠皮肤上分离的原代角质形成细胞共培养,发现r IL-17A显著抑制DETC中IGF-1的表达量,说明IL-17A通过表皮细胞阻碍DETC产生IGF-1。体外r IL-1β和r IL-23刺激DETC可显著抑制IGF-1的表达。野生型小鼠创缘注射r IL-1β和r IL-23,明显降低创缘表皮组织中IGF-1的表达量,下调IGF-1阳性的DETC比例,抑制创面愈合;而注射IL-1β/IL-23的中和抗体,表现出相反结果。这些结果充分说明IL-1β和IL-23可直接影响DETC产生IGF-1。3.2、IL-1β与IL-23是IL-17A抑制IGF-1在创面表皮表达的中介。我们将DETC与角质形成细胞共培养,发现r IL-1β和r IL-23可直接抑制DETC产生IGF-1,但r IL-17A却不能直接发挥抑制效应。在体创面愈合实验发现创缘单独阻断IL-17A可加速创面修复,而如果同时注射r IL-1β和r IL-23,却抑制创面修复。创缘单独注射r IL-17A可抑制创面愈合,但注射r IL-17A同时阻断IL-1β和IL-23却可促进愈合。这些结果提示IL-1β和IL-23可作为IL-17A对IGF-1发挥作用的中介。3.3、IL-17A和IL-1β/IL-23在创缘表皮构成正反馈回路。体外实验验证r IL-17A可增强角质形成细胞中IL-1β和IL-23的m RNA和蛋白表达水平。体内实验发现Il-17a-/-小鼠的创缘表皮组织中IL-1β和IL-23的表达水平均明显低于野生型小鼠。创缘注射IL-17A的中和抗体可降低表皮中IL-1β和IL-23的表达水平,且IL-17A的中和剂量越高IL-1β和IL-23的表达水平越低。此外,创缘注射r IL-17A可显著增加创缘表皮中IL-1β和IL-23的表达水平,并且r IL-17A的注射剂量越高IL-1β和IL-23的表达水平越高。这些结果说明IL-17A是皮肤损伤后促进创缘表皮组织产生IL-1β和IL-23的重要因素。Vγ4 T细胞清除及细胞回输实验验证IL-17A可促进IL-1β和IL-23的表达。结合IL-1β和IL-23促进IL-17A表达的文献报道,我们认为皮肤损伤后IL-17A可能与IL-1β和IL-23构成正反馈回路调控创面愈合。3.4、IL-1β和IL-23调控DETC表达IGF-1依赖NF-κb和STAT3信号通路。通过体内创缘皮下注射细胞因子或中和抗体,以及体外细胞因子培养刺激DETC,发现IL-1β可抑制DETC表达IGF-1,而IL-23可能仅起增强IL-1β抑制IGF-1表达的作用。检测IL-1β/IL-23下游信号通路如NF-κb和STAT3的磷酸化水平,发现IL-1β和IL-23可显著增强NF-κb和STAT3的磷酸化水平,促进NF-κb和STAT3从胞浆转移至胞核。此外,阻断NF-κb信号通路而非STAT3信号通路可显著提高DETC表达IGF-1的水平。因此我们认为NF-κb信号通路在IL-1β调控DETC表达IGF-1中发挥着更为重要的作用。综上所述,Vγ4 T细胞在皮肤创伤早期通过CCR6-CCL20通路从真皮迁移浸润至表皮,是创缘表皮组织中IL-17A的主要来源,导致创面愈合延迟。此外,Vγ4 T细胞来源的IL-17A通过增强表皮组织中IL-1β/IL-23的表达,间接阻碍DETC产生IGF-1。IL-1β/IL-23通过激活NF-κb和STAT3信号通路阻碍IGF-1的表达,其中IL-1β活化NF-κb信号通路为更重要的调控IGF-1的机制。本课题研究聚焦于Vγ4 T细胞对创面愈合的影响以及Vγ4 T细胞对DETC的调控机制,对创面愈合理论提供了有益补充,为今后促进人类创面早期修复的研究和治疗提供了新靶点和新思路。