股骨头缺血性坏死(avascular or ischemic necrosis of femoral head,ANFH)是一种常见的骨关节疾病,与多种致病因素有关,可能存在多种发病机制。近年来有些研究认为,ANFH可能是一种骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchamal stem cells,BMSCs)减少性疾病;已有研究报道显示,运用自体红骨髓移植治疗ANFH,取得了一定的疗效。但是,尚缺乏利用培养的BMSCs移植,对ANFH治疗作用的理论和实验依据。BMSCs具有高度增殖和多向分化潜能,经定向诱导可分化为骨、软骨、脂肪、肌、肌腱、神经细胞等。目前,BMSCs已成为骨组织工程技术研究中,最为重要的种子细胞。本实验就BMSCs的体外培养、扩增,向成骨细胞诱导分化,及其移植对ANFH的治疗作用,进行观察和分析;旨在探讨BMSCs移植,对ANFH的治疗作用、修复机理以及合理的治疗方法。一、BMSCs向成骨细胞的诱导分化及其形态学特点目的:BMSCs具有高度增殖和多向分化潜能;目前,已成为骨组织工程技术中最为重要的种子细胞。本实验旨在通过对BMSCs的体外培养和扩增,诱导其向成骨细胞的方向分化,利用光镜和电镜,观察其细微和超微结构特点。方法:从成年新西兰大耳白兔髂后上嵴处抽取骨髓,种植于6孔细胞培养板内,培养液为含20%胎牛血清DMEM液,放入细胞培养箱内培养,传代密度为1×106/cm2。第3代细胞培养,部分加入诱导剂。诱导剂为10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10-8mmol/L地塞米松,50mg/L维生素C。培养2周后,诱导和未加诱导的BMSCs,分别进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白(BMP)和钙化结节检测,并用光镜、扫描和透射电镜,进行形态学观察。结果:全骨髓培养后,BMSCs呈放射状克隆集落贴壁生长。通过消化传代后,细胞呈长梭形分散排列,少量细胞呈星形,胞浆丰富,常有1～2个细胞核,位置居中。碱性磷酸酶呈强阳性反应,钙化结节和BMP免疫组织化学染色均呈阴性反应。经诱导的细胞生长旺盛,形体饱满,体积逐渐增大,呈鱼群样排列。碱性磷酸酶、钙化结节和BMP免疫组织化学均呈现阳性反应。扫描电镜观察显示,BMSCs呈长梭形,大部分细胞为单核。经过向成骨细胞分化诱导后,胞体增大,细胞呈现双核增多现象。透射电镜观察显示,BMSCs间无明显连接结构,细胞核不规则。经过诱导后的细胞,细胞间出现缝隙连接,细胞器更为丰富,并出现大量的基质小泡、髓样结构和空泡状结构,细胞核常呈圆形或椭圆形。结论:BMSCs可通过全骨髓培养、细胞贴壁生长筛选法,在体外进行大量扩增;在体外可通过定向诱导,向成骨细胞分化。BMSCs在体外经过成骨诱导后,细胞间出现典型的缝隙连接,细胞器更为丰富,并出现大量的基质小泡、髓样结构和空泡状结构,这些变化可能是诱导后成骨细胞的超微结构特征。二、BMSCs移植对实验性家兔ANFH的治疗作用目的:ANFH可能有多种发病机制;近年来有些研究认为,ANFH可能是一种BMSCs减少性疾病。本实验采用体外扩增的BMSCs移植,治疗实验性家兔ANFH,旨在探讨其治疗作用和修复机制。方法:48只成年新西兰大白兔,随机分成A、B、C、D四组,每组12只。A组为单纯造模组,B组为髓芯减压组,C组为自体BMSCs移植组,D组为同种异体BMSCs移植组。全部采用液氮冷冻股骨头负重区的方法,制作ANFH的实验动物模型。四组实验动物,分别于术后2、4、6、8周,各处死3只动物,进行股骨头标本的大体解剖学观察、X-线检查以及组织学观察。结果:采用液氮冷冻法,成功制备了ANFH的动物模型,所有标本在组织学上,表现出骨坏死与修复过程。在X-线上,呈现股骨头密度增高、骨小梁结构紊乱和软骨下囊性变,个别标本还出现了塌陷现象和类似骨性关节炎的表现。B组标本在2周时,钻孔区边缘出现较多的成骨细胞,并有新骨形成,钻孔的中央部空虚,至8周时钻孔中央形成骨髓组织。在X-线上,术后2周时钻孔缺损区边缘密度有所增高,中心密度减低;8周时钻孔区中心仍呈低密度,而边缘密度增高,并形成硬化线。在C、D两组的股骨头标本,其钻孔区组织学变化大致相似。术后2周时,钻孔缺损区内有大量的成骨细胞,只有D组的缺损区内,常见一些浆细胞和淋巴细胞。4周时钻孔区内有大量骨小梁形成及类骨质填充。8周时钻孔区内骨小梁更趋成熟,小梁间有骨髓组织填充。在X-线上,C、D两组标本于术后4周时,整个钻孔区密度均增高,8周时出现正常的骨小梁结构。结论:液氮冷冻法是制备ANFH家兔模型的良好方法;形成ANFH后,由于BMSCs数目减少,导致修复能力下降,单纯髓芯减压术疗效有限;髓芯减压术联合BMSCs移植,对ANFH有着较好的治疗作用,修复机制主要以膜内化骨方式为主;采用同种异体BMSCs移植修复ANFH,虽在早期出现了轻度的免疫反应,但其最终的修复效果,与自体BMSCs移植无明显差异。三、BMSCs向成骨细胞诱导后移植对实验性家兔ANFH的治疗作用目的:通过BMSCs向成骨细胞诱导分化后移植,是否能更早更好的形成骨组织,目前尚缺乏相关研究。本实验采用诱导和未加诱导的BMSCs,移植治疗家兔ANFH,旨在探讨两种移植方式的优劣性。方法:成年新西兰大耳白兔24只,随机分为A、B两组,每组12只。A组为BMSCs移植组,B组为向成骨细胞诱导分化的BMSCs移植组。每组的实验动物,分别于术后2、4、6、8周,各处死3只动物,进行股骨头标本X-线检查、组织学观察、图象分析以及免疫组织化学检测。同时将诱导后1、2、3周的第3代细胞爬片,进行免疫组织化学检测。结果:BMSCs经过向成骨细胞诱导分化2周后,BMP免疫组织化学染色观察显示,有部分细胞呈现阳性反应;两组股骨头标本术后2周时,BMP免疫组织化学染色表明,几乎全部细胞呈现阳性表达。两组标本的X-线变化基本一致。随着时间的进展,缺损区密度逐渐增高,6周时出现骨小梁结构,8周时缺损区呈现正常的骨小梁结构。两组标本的组织学变化也大致相似。术后2周时,钻孔缺损区内有大量的成骨细胞。4周时缺损区内有大量骨小梁形成及类骨质填充。在8周时缺损区内骨小梁趋于成熟,并有大量骨髓组织形成。经过统计学分析表明,两组缺损区骨小梁的面积百分比值,起差异无统计学意义。结论:向成骨细胞诱导分化和未加诱导的BMSCs,对于移植治疗ANFH的作用基本相同,其修复过程也大体相似;股骨头局部的内环境,对于BMSCs的成骨诱导作用,强于体外诱导剂的诱导作用。四、不同密度BMSCs移植对实验性家兔ANFH的治疗作用目的:采用BMSCs移植方法修复骨缺损时,往往需要考虑两个方面的问题:一是充足的BMSCs数目,二是合适的干细胞移植密度。本试验采用髓芯减压术联合不同密度的BMSCs移植,对ANFH的治疗作用进行了观察和分析,旨在探索合适的BMSCs移植密度,为临床提供依据。方法:成年新西兰大耳白兔40只,随机分为A、B、C、D、E两组,每组8只。A组为104密度级别BMSCs移植组,B组为105密度级别组,C组为106密度级别组,D组为107密度级别组,E组为108密度级别组。每组实验动物,分别于术后2周处死1只、4、6周各处死2只, 8周处死3只,进行股骨头标本X-线检查、组织学观察、图象分析。结果:A组实验动物的股骨头标本X-线变化,在术后2周时,钻孔缺损区边缘密度有所增加,缺损区中心密度较低。4周时缺损区密度有不均匀增高。6周时缺损区有模糊的骨小梁结构出现,部分区域呈现低密度。8周时部分区域有清晰的骨小梁结构,部分区域呈低密度腔隙。B、C、D、E组实验动物的股骨头标本,其X-线变化基本一致。随着时间的进展,缺损区密度逐渐增高,6周出现骨小梁结构,8周时缺损区呈现正常的骨小梁结构。在组织学上,A组实验动物的股骨头标本术后2周时,钻孔边缘形成较多新生骨组织,新生骨内侧有一个成骨细胞聚集层,而钻孔区中心充满了炎症细胞。4周时,钻空区新生骨小梁增多,但并不在全部区域,部分标本在钻孔中央形成少量骨组织,部分标本无骨组织形成。8周时钻孔边缘区充满分布不均匀的骨小梁组织和骨髓组织。B、C、D、E组实验动物的股骨头标本,其组织学变化也大致相似。术后2周时,钻孔缺损区内有大量的成骨细胞。4周时缺损区内有大量骨小梁形成及类骨质填充。在8周时缺损区内骨小梁趋于成熟,并有大量骨髓组织形成。经过统计学分析表明,两组缺损区骨小梁的面积百分比值,无显著性差异。结论:利用BMSCs移植治疗骨缺损的数学模型,存在一定的局限性;105-108密度级别的BMSCs移植,修复ANFH呈现相似的结果;提示在采用培养的BMSCs移植修复ANFH时,不宜采用104以下的密度级别,应该尽可能提高移植细胞的密度。五、自体松质骨联合BMSCs移植对实验性家兔ANFH的治疗作用目的:采用自体松质骨移植,是治疗ANFH的常用方法之一,其临床失败率,可能与BMSCs的数量减少,修复过程不活跃有关。本试验旨在探讨联合应用BMSCs,在自体松质骨移植治疗ANFH方面的作用。方法:24只成年新西兰大耳白兔,随机分为A、B两组,每组12只,A组为自体松质骨联合BMSCs移植组,B组为自体松质骨移植组。每组实验动物,分别于术后2、4、6、8周,各处死3只动物,进行股骨头标本的X-线检查、组织学观察、生物力学检测、扫描电镜观察与钙磷能谱分析。结果:在X-线上,随着时间进展,A组钻孔区密度逐渐增高,出现骨小梁结构,钻孔边缘边界出现放射状骨小梁接合现象,8周时股骨头内出现张力小梁和压力小梁,钻孔边缘交界区骨小梁接合良好;B组X线变化有两种趋势,修复成功的标本,与A组变化大体相似,修复失败的标本主要是随着时间的增加,股骨头有不同程度的塌陷和植骨区的骨吸收现象。组织学观察,A组2周时,移植骨发生坏死,再血管化过程开始,成骨细胞募集,新生骨将移植骨焊接在一起, 6周时骨塑形现象活跃,8周时可以见到塑形的板层骨小梁和成熟的骨髓组织。B组修复成功的标本与A组有着相似的变化。在修复失败的股骨头标本中,2周时再生血管少,成骨细胞募集不良,新生骨形成较少,6-8周时逐渐出现了较严重的骨吸收现象,坏死骨仍然存在。扫描电镜观察可见,在8周时,修复成功的标本,骨小梁密集,髓腔间隙小,胶原纤维排列不够均匀整齐。钙磷能谱分析无明显区别。随着时间的增加,在两组修复成功的标本,生物力学性能逐渐增加;而且,在自体松质骨联合BMSCs移植组,其生物力学性能明显优越于单纯松质骨移植组。结论:单纯采用自体松质骨移植治疗ANFH,由于BMSCs的募集减少,再血管化过程障碍,常常导致修复的失败;自体松质骨联合BMSCs移植治疗,可以提高治疗ANFH的成功率。