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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)属革兰氏阴性杆菌,能引起以发病水貂呼吸困难、突然死亡,鼻孔及嘴角流血为主要特征的水貂出血性肺炎。该病发病急、死亡快、呈地方性流行,已成为危害水貂养殖业最严重的细菌性传染病之一。同时,该病原还能引起患者的囊性纤维化、非囊性纤维化的肺支气管扩张及肺部的慢性感染等疾病,在公共卫生方面亦具有重要的意义。自1953年首次确认铜绿假单胞菌是水貂出血性肺炎的病原以来,该病蔓延迅速,给全球水貂养殖业带来了巨大的经济损失。长期以来,抗生素是人们在临床中防治铜绿假单胞菌的主要工具。然而,近些年来随着抗生素的滥用,铜绿假单胞菌耐药率呈现出日渐升高的趋势,应用抗生素对该病原的防治效果越来越差。同时常规灭活苗免疫保护周期短及血清型单一的弊端决定了其也不能有效防控该病原。因此,对该病原新的防治手段的实施刻不容缓。采用减毒沙门菌运送DNA疫苗已成为近年来研究的热点。减毒沙门菌在侵入肠相关淋巴组织后,能够将所表达的重组抗原传递至机体的黏膜表面,诱导保护性的体液免疫及细胞免疫效应来对抗特定的病原体的侵入。本研究以减毒鼠伤寒沙门菌LH430株为基础构建了asd基因突变的平衡致死系统,以此系统携带了铜绿假单胞菌外膜蛋白F(F190-342)和I(I21-83)重要的表位抗原基因,并进行了该重组菌株对小鼠模型及水貂的实验免疫研究。从辽宁、山东及吉林等地送检的病死水貂肺脏中分离到20株疑似铜绿假单胞菌病原菌,通过培养特性、生化试验及16S r RNA测序的方法鉴定所分离的病原菌为铜绿假单胞菌。研究了所分离铜绿假单胞菌株的血清型、抗生素敏感性及致病性试验。铜绿假单胞菌分离株的血清为G型和B型,其比例分别为85%和15%;药敏试验表明分离株耐药现象比较严重,对临床常用的洛美沙星、环丙沙星、庆大霉素等的耐药率分别为65%、55%及50%,对哌拉西林、头孢他啶、头孢哌酮、氨曲南的耐药率为60%、55%、50%及70%;小鼠致死性试验表明,分离株之间毒力差异很大,少数菌株如ZHDL9、ZHDL6等表现出较强的毒力。以ZHDL9为代表株建立了小鼠鼻腔感染模型,采用建立的感染模型测定ZHDL9对小鼠的绝对致死量(LD100)为5.0×107CFU。利用Red重组系统,通过同源基因臂重组的方式构建了鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株?asd LH430。该缺失株失去了在二氨基庚二酸(DAP)阴性环境中生存的能力,保留了与亲本菌株相同的生化特性,稳定遗传了所缺失的1107 bp的缺失片段;同时将asd+的原核表达质粒p YA3493转入?asd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统?asd LH430(p YA3493)构建成功;之后将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,表明该系统能够高效表达绿色荧光蛋白,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。以ZHDL9基因组为模板,通过分子生物学的方法扩增了铜绿假单胞菌外膜蛋白F和I的重要抗原表位基因F190-342(F1)和I21-83(I2),生物信息学初步分析表明所扩增得到的序列高度保守。之后,将扩增的两段基因融合在一起(F1I2),并将该融合基因转入所构建的平衡致死系统中,成功构建重组菌株?asd LH430(p YA-F1I2)。该菌株能够稳定遗传所携带的F190-342和I21-83基因;能够通过胞外分泌的方式表达F1I2融合蛋白,且所表达蛋白与兔抗F1I2高免血清具有较好的反应原性;同时,与亲本菌LH430相比,?asd LH430(p YA-F1I2)毒力下降了约4.2倍,这表明重组菌株的毒力进一步降低,对动物更加安全。将表达PA保护性抗原F1I2的重组鼠伤寒沙门菌株?asd LH430(p YA-F1I2)免疫BALB/c小鼠及水貂,探讨了接种途径对免疫效果的影响,评估了该重组菌在小鼠及水貂体内的免疫应答,检验了免疫该重组菌的小鼠对鼠伤寒沙门菌和PA的保护效力。将2.0×1010 CFU和2.0×108 CFU重组菌株?asd LH430(p YA-F1I2)分别通过口服和皮下注射途径免疫BALB/c小鼠,结果表明皮下接种途径产生了较高水平的抗-F1I2血清Ig G滴度及肺部高水平的Ig G和Ig A滴度;高水平的血清IFN-γ及IL-4含量表明皮下免疫组诱导了较强的Th1/Th2的免疫效应;CD4+/CD8+的变化表明皮下免疫组诱导了宿主较强的免疫应答反应。与此同时,口服免疫组能给免疫小鼠提供针对鼠伤寒沙门菌强毒株ATCC14028的攻击的部分保护力(12/15),而皮下接种组则能提供完全的保护力(15/15);当使用1×LD100PA强毒株ZHDL9进行鼻腔攻毒后,口服免疫组不能提供有效保护(7/17),而皮下免疫组能够提供较好的保护(14/18)。之后,将2.0×108 CFU重组菌株?asd LH430(p YA-F1I2)通过皮下注射免疫7月龄水貂,结果显示免疫水貂能产生较高水平的针对沙门菌和PA重组蛋白F1I2的血清Ig G。在二免后的第30天无菌采取水貂脾脏及血液,淋巴细胞转化试验表明,免疫水貂体内产生了细胞免疫应答反应;Eli-spot实验则证明了分泌沙门及F1I2特异性抗体的细胞广泛存在。本研究构建的铜绿假单胞菌的重组沙门菌基因工程菌株?asd LH430(p YA-F1I2)在小鼠及水貂体内实验能显著诱导实验动物机体的细胞和体液免疫应答反应,有望成为实用有效的新型双价基因工程活疫苗。