背景和目的： 动脉粥样硬化(AS)严重威胁人类健康，虽然大量的流行病学资料显示传统的危险因子是动脉粥样硬化的主要危险因素，但动脉粥样硬化仍然有许多潜在的病因亟待探索。一些研究表明病原微生物感染可能参与了动脉粥样硬化的发生发展，感染后的炎症反应在动脉粥样硬化的发生过程中发挥重要作用。自从Fabricant利用禽类疱疹病毒成功诱发鸡动脉粥样硬化以来，有关病毒感染与AS的关系逐渐受到人们重视，血清流行病学和分子生物学的研究资料表明，人类巨细胞病毒(HCMV)抗原及其DNA序列存在于AS的病灶组织，主要见于血管平滑肌细胞(SMCs)和内皮细胞(ECs)，且AS患者血清HCMV的抗体阳性率明显增高，提示HCMV的感染在AS的形成和发生发展过程中可能起重要作用。迄今为止，对于HCMV如何参与AS的发病机制尚缺乏深入的了解，病毒对体外靶细胞的作用可以反映病毒对体内细胞的直接作用，研究体外情况下HCMV感染后血管壁细胞的生物学效应，对阐明HCMV致AS机理具有非常重要的意义。 低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)是在AS病变部位SMC上表达的唯一脂蛋白受体，LRP结构或功能的紊乱可能是引发AS形成和发展的一个重要因素，LRP作为AS疾病的一个危险因子，其致病的主要原因可能是促发泡沫细胞的形成，HCMV感染后SMC的LRP表达及脂质代谢方面的变化及其机理是本课题重点研究内容。 如何调节和控制病毒对宿主细胞的作用是病毒性疾病治疗和预防的一个重要方面。HCMV的反义寡核苷酸(ASON)能与特定病毒基因互补，抑制该基因的复制、转录或翻译，达到抗病毒活性的目的。临床研究资料表明抗病毒药物更昔洛韦(ganciclovir)在拮抗HCMV和细胞相互作用方面有很好的作用，那么，体外情况下，更昔洛韦、ASON如何控制病毒蛋白及核酸代谢，如何在分子水平上调节宿主细胞的蛋白质合成与表达，开展有关这方面的研究将为AS的治疗和预防提供理论基础。 综上所述，我们设想：1、HCMV与ECs：①HCMV感染ECs可能导致细胞形态改变，引起通透性改变和内皮完整性的变化；②、感染后的细胞功能可能发生改变，进一步导致血小板及单核细胞在内皮的粘附；③感染性病毒颗粒的释放可能成为侵袭第三军医大学博士学位论文SMC的病毒来源。2、HCMV与SMC:①HCMV感染SMC可能导致感染细胞的增殖;②HCMv所诱导的转化作用可能会导致SMC表面L即活性的异常表达，进而引起宿主细胞脂质代谢的改变;③HCMV病毒感染可能对SMC粘附分子表达产生影响;④外源性更昔洛韦、HCMV的ASON对IE基因和L基因，SMC的LRP表达、TG和TC的代谢产生影响。 基于以上设想，拟主要观测:①感染细胞形态、脂质代谢变化，主要包括IE基因、L基因变化、粘附分子改变。②感染细胞表面LRP变化及细胞脂质代谢、病毒核酸代谢、病毒抗原表达;③更昔洛韦、HCMV的ASON作用后平滑肌细胞IE基因及LRP表达等方面的变化，④从分子水平调查CHD患者HCMV的感染状况。探讨以上内容的变化特点和规律，在细胞和分子水平上阐述HCMV致血管壁细胞的生物学效应，为HCMV致AS发病机理的研究及其治疗和预防提供一定的理论基础。 方法和技术路线: 1.采用HCMV AD169株感染体外培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞，建立HCMV的细胞感染模型。 2.对于血管内皮细胞的感染模型，主要运用荧光显微镜观测病毒抗原的表达，荧光定量PCR方法动态观测病毒DNA代谢变化，ELISA和细胞ELISA方法检测感染细胞粘附分子(sI以M一1、V以M一l)的变化，流式细胞仪动态测定HEC感染后的凋亡状况，化学法测定ECs感染后的ATP酶活性的改变。 3.对于平滑肌细胞体外感染模型，实验分四组(对照组;感染组;更昔洛韦作用组;反义寡核昔酸作用组)，主要应用RT一PCR方法和细胞EL工SA观测不同因素作用后LRP一mRNA和蛋白的表达，微量化学分析法测定细胞内脂质的改变，应用PCR方法检测HCMV的工E基因、L基因的变化规律，常规法观测SMC增殖指数的变化。 4.为验证HCMV感染对冠状动脉粥样硬化的效应，运用ELISA和捕捉EL工SA法、放射免疫分析技术、定量PCR技术检测了经冠脉造影确诊的119例CHD患者血清HCMV一IgM、IgG抗体、HCMV一DNA、血清ET、TNF和hs一CRP的水平。 5.各项指标以均数士标准差(万士s)表示，两组均值间比较用t检验，各组间率的比较采用了检验，统计学处理均在计算机上用Origan软件完成。P<0 .05表示有显著性差异。第三军医大学博士学位论文 主要结果: 一、H哪V对体外培养血管内皮细胞的作用 1.感染的ECS内存在病毒抗原表达:感染的细胞胞浆内出现片状或颗粒性黄绿色荧光。 2.病毒增殖动态:HCMV感染后12小时即可检测到病毒，以后病毒滴度逐渐上升，48小时病毒增殖达高峰，随后缓慢下降。 3.感染细胞形态变化:感染后24小时未见明显改变，48小时后细胞胞浆可见微泡样结构，核旁空泡及大量空泡出现。电镜结果显示，48小时可见线粒体肿胀、内质网扩张、溶酶体和高尔基体增生感染72小时可见次级溶酶体增多，线粒体肿胀，脊呈空泡样，感染24小时后，相继发现粗颗粒病毒样包涵体、病毒样颗粒、巨大的细颗粒病毒样包涵体。