第一部分:大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离纯化与鉴定目的:从大鼠胫骨分离培养骨髓间充质干细胞,观察间充质干细胞的细胞形态,对其表面标志物进行鉴定,为运用骨髓间充质干细胞治疗大鼠半横断损伤做准备。方法:无菌条件下,选取幼年SD大鼠,收集其股骨中单个核细胞,运用全贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,并按照常规对提取的骨髓间充质干细胞传代、冻存,培养三代后的细胞使用流式细胞术鉴定其表面标志物CD29,CD90,CD34和CD45。结果:原代接种24小时即可见较多长梭形或多角细胞贴壁。培养至5至7天原代细胞达到80%至90%,并融合成片,细胞集落呈漩涡状排列。消化后1:2传代接种4小时后开始贴壁伸展,3天后及又可以达到80%的融合。经流式细胞仪检测,MSCs均一地表达CD29、CD90;而CD34、CD45阴性。结论:成功分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞。第二部分:大鼠半横断损伤后巨噬细胞亚群变化目的:构建大鼠半横断损伤模型,观察大鼠半横断损伤后不同时间点巨噬细胞亚群改变。方法:1.建立大鼠左侧T9脊髓半横断损伤模型;2.27只健康雄性6周龄SD大鼠随机分为2组:1,假手术组;2,对照组;3.分别在术后3天、12天、28天组织学检查和以及免疫组化(M1:iNOS、M2:CD206)等检查。结果:1.根据排除标准,有3只大鼠因不完全半横断而被淘汰,最后留24只。2.M1型巨噬细胞标志物iNOS在SCI后3天开始表达,并在12天达到高峰,随后下降并在SCI后28天持续低水平表达。3.M2型巨噬细胞标志物CD206在大鼠半横断损伤后3天即明显高表达,而后下降,在12天与28天明显下降。结论:脊髓半横断损伤后m2型巨噬细胞表达短暂,而m1型巨噬细胞表达时间较长,sci后12天可以作为大鼠半横断损伤模型中巨噬细胞调节相关研究的时间点。第三部分:骨髓间充质干细胞的标记及负载胶原支架目的:通过对骨髓间充质干细胞进行荧光标记及负载于胶原支架干细胞观察细胞在胶原支架上粘附、固定与分布。方法:1.8μmol/lcm-dil标记骨髓间充质干细胞,运用流式细胞仪检测标记率,cck-8检测检测标记细胞增殖情况。2.通过细胞计数制备一定浓度的骨髓间充质干细胞细胞悬液,接种于胶原支架并共培养。3.扫描电镜观察胶原支架与支架干细胞进行观察。结果:1.骨髓间充质干细胞标记cm-dil后均显示红色荧光,细胞呈梭形,能保持良好的形态,cm-dil标记率为98%,干细胞增殖活性未受影响。2.胶原支架干细胞复合物共培养12天后可以看到间充质干细胞在胶原支架中心与边缘呈现相对均匀分布。3.扫描电镜结果显示胶原支架具有合适的孔隙度和纳米级线性纤维,可以提供一个三维空间的细胞粘附。结论:胶原支架可以作为骨髓间充质干细胞固定粘附的载体。第四部分:间充质干细胞通过调控巨噬细胞亚群促进大鼠半横断脊髓损伤修复目的:通过运用胶原支架复合物修复大鼠脊髓半侧切损伤,分析和评价mscs对半切损伤后巨噬细胞亚型m1/m2极化的影响及其促进神经功能恢复的效果。方法:一、建立大鼠t9左侧脊髓半横断损伤模型:99只健康雄性6周龄sd大鼠随机分为4组:1,假手术组(n=20);2,对照组(n=32);3,cs移植组(n=26);4,cs+msc移植组(n=21)。二、统计术后21天内大鼠死亡率,每周一次bbb评分,分别术后12天、4周和8周行组织学检查及免疫组化(inos、cd206、nf、gfap)、细胞凋亡tunel染色等检查。结果:1.8只老鼠因不完全半横断而被淘汰(对照组4只,CS组2只,CS/MSC组2只),最后留91只老鼠。2.CS/MSC组的死亡率比CS组与对照组低,左后肢功能的恢复较其他组快。在8周末,CS/MSC组的BBB评分明显高于CS组与对照组。3.H&E染色显示,造模后12天与8周时CS/MSC组的空洞较CS组与对照组明显较小,而第8周时,CS组空洞较对照组小。4.免疫组织化学显示,12天时,CS/MSC组的iNOS、Tunel、GFAP表达较对照和CS组少,而NF-200、CD206表达增高。结论:胶原支架和骨髓间充质干细胞的联合应用可以取得显著的治疗作用。骨髓间充质干细胞可以调控巨噬细胞亚群M1/M2极化,通过促进M1向M2极化减少炎症巨噬细胞浸润,抑制凋亡与空洞、瘢痕的形成,促进神经再生。