论文部分内容阅读
研究背景和目的Ras/Raf/ERK信号通路是肝癌细胞中较为活跃的信号通路之一，也是目前唯一的肝癌靶向药物索拉非尼的主要作用靶点。但是据报道，临床肝癌组织样本只有23%（25/109）表达pERK[1]，而pERK是Ras/Raf/ERK信号通路中的一个关键性分子。这意味着相当部分肝癌患者可能先天性缺乏对索拉非尼的敏感性。另外据报道，索拉非尼疗效通常持续时间有限，其获得性耐药的机制在于Ras/Raf/ERK通路受抑后PI3K/AKT/mTOR通路获得代偿性活化[2]。因此，不仅在决定索拉非尼用药前需要筛查药物靶点，而且在用药过程中需要不断监测其耐药状态。遗憾的是，目前临床上尚没有建立指导索拉非尼个体化治疗的实验室诊断技术。至于受检样本，我们认为在无法获取或需要反复获取肝癌样本的情况下，从原发灶或转移灶释放进入外周血的循环肿瘤细胞（CTCs）由于可多次实时采集则是最为理想的选择。为此，本课题在筛查临床肝癌组织样本药物靶点的基础上，将以肝癌CTCs为样本，建立同时检测上述两条通路中的两个代表性靶分子pERK和pAKT的多色免疫荧光染色方法，并通过临床检测，评价该方法的可行性以及用于指导索拉非尼个体化治疗肝癌的潜能。方法1、应用免疫组织化学方法检测18例临床肝癌组织连续切片中pAKT和pERK表达，了解肝癌组织的pAKT/pERK表达谱。2、将差异表达pAKT/pERK的不同肝癌细胞系分别掺入外周血（外周血肝癌CTCs模型），建立和优化在鉴定肝癌CTCs的基础上检测其pAKT/pERK表达的多色免疫荧光染色技术，其中鉴定肝癌CTCs的标志物采用目前国际上通行的广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin）抗体。3、采用Ficoll密度梯度离心法从临床肝癌血样中富集CTCs，采用离心涂片法制作细胞涂片。4、采用上述所建立的多色免疫荧光染色方法检测30例临床肝癌CTCs样本中pAKT/pERK表达，绘制肝癌CTCs的pAKT/pERK表达谱。5、比较肝癌CTCs与对应的肝癌组织pAKT/pERK表达检测结果，分析二者之间的相关性。6、应用索拉非尼治疗8例晚期肝癌患者，比较治疗前后外周血CTCs数量及其pAKT/pERK表达谱变化情况，并统计相关临床病理资料及随访生存信息，初步评估肝癌CTCs计数及其pAKT/pERK表达谱检测在指导索拉非尼个体化治疗中的应用潜能。结果1、建立的CKs/pAKT/pERK多色免疫荧光染色方法可在鉴定肝癌CTCs的同时检测其pAKT/pERK表型，可准确检测出不同细胞之间pAKT和pERK的表达差异。2、在HCC组织中检测到4种不同的pAKT/pERK表型，分别为pAKT+/pERK+、pAKT+/pERK-、pAKT-/pERK+和pAKT-/pERK-。在18例肝癌患者中，pAKT+/pERK+患者2例，占11.1%，pAKT+/pERK-患者13例，占72.2%，pAKT-/pERK+患者2例，占11.1%，pAKT-/pERK-患者1例，占5.6%。其中pAKT+患者共15例，占83.3%，pERK+患者共4例，占22.2%。3、在HCC CTCs中也检测到与组织对应的4种不同的pAKT/pERK表型。4、不同肝癌个体的CTCs之间pAKT/pERK表型不尽相同。在30例HCC外周血中，28例检出CTCs，检出率93.3%，平均31±18个。不同HCC患者具有不同表型的CTCs。28例检出CTCs的HCC患者中4种表型分别为：pAKT+/pERK+5例，占17.9%；pAKT+/pERK-18例，占64.3%；pAKT-/pERK+3例，占10.7%；pAKT-/pERK-2例，占7.1%。其中pAKT阳性患者共23例，占82.1%，pERK阳性患者共8例，占28.6%。5、同一肝癌个体的不同CTCs之间pAKT/pERK表型也不尽相同。28例患者中，除5例患者体内仅检测到1种表型的CTCs外，其余大部分患者体内同时检测到2种或以上表型的CTCs，甚至同时检测到全部4种表型的CTCs，不同表型的CTCs数目存在差异，占所有检出CTCs的比例也不相同。6、肝癌CTCs与对应的肝癌组织pAKT/pERK表达检测结果高度一致，不同pAKT/pERK分型两种方法检测结果之间无统计学差异（P>0.05）。在同时应用两种方法检测的18例患者中，除1例未检出CTCs，其余17例中有16例检测结果一致，占94%。其中1例组织学检测结果为pERK-，此例患者外周血检出27个CTCs，但在这27个CTCs中检测出8个pERK+CTCs。7、8例HCC患者在接受索拉非尼治疗后2周，外周血CTCs均有不同程度下降，从用药前31±10个下降到20±12个。其中2例CTCs表型为pAKT-/pERK+的患者，CTCs数目下降程度最为显著，分别从26个和27个下降至5个和7个，下降幅度分别为80.8%和74.1%；2例CTCs表型为pAKT+/pERK+的患者，CTCs数目下降程度较小，分别从27个和25个下降至15个和13个，下降幅度分别为40.7%和48.0%；3例CTCs表型为pAKT+/pERK-的患者及1例CTCs表型为pAKT-/pERK-的患者，CTCs数目下降幅度不大，从31个、36个、53个和24个分别下降到25个、29个、43个和20个，下降幅度分别为19.3%、19.4%、18.9%和16.7%。不同分子表型CTCs下降幅度差异具有统计学意义。表明pAKT-/pERK+患者对索拉非尼最为敏感，pAKT+/pERK+患者次之，而pAKT+/pERK-患者和pAKT-/pERK-患者对索拉非尼不敏感。结论建立的CKs/pAKT/pERK多色免疫荧光染色方法简便实用，可用于肝癌CTCspAKT/pERK表型鉴定；肝癌CTCs可以替代肝癌组织进行pAKT/pERK分子表型检测，甚至具有更多优势；不同肝癌个体的CTCs之间以及同一肝癌个体的不同CTCs之间pAKT/pERK表型存在异质性；肝癌CTCs pAKT/pERK表型检测可用于临床指导索拉非尼个体化治疗，以及在治疗过程中监测和评价疗效；对pAKT-/pERK+患者和pAKT+/pERK+患者可积极应用索拉非尼治疗。