研究背景肝癌是目前发病率和死亡率最高的肿瘤之一,根据1999年上海市肿瘤流行病学调查,肝癌的发病率在男性40.0/10万,在女性为14.8/10万,分别列恶性肿瘤发病率第3位和第5位。据1998年统计,全球肝癌死亡率为10.3/10万,在全球男性中占第7位,女性中占第9位。在我国,根据1997年报道27个省、市、自治区1990-1992年抽样地区分析,肝癌死亡率为20.37/10万(男性29.01/10万,女性11.21/10万),占恶性肿瘤死亡率的第2位,在男性中仅次于胃癌,在女性则次于胃癌和食管癌居第3位。原发性肝癌起病隐匿,在早期(亚临床肝癌)并无明显的症状和体征,若具有典型的症状和体征,则已为中晚期,治疗效果较差。晚期肝癌的治疗仍以放、化疗为基础的综合治疗为主,在肝癌的治疗中,复发转移和超级耐药始终是非常棘手的问题。肝癌复发转移是一个多步骤、多环节的过程,其分子机制涉及癌基因、抑癌基因、转移相关基因、生长因子及其受体、细胞外基质、肿瘤血管、机体免疫等多个环节。近年来,人们在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、食道癌模型中发现了上皮-间质转化(EMT)现象,说明EMT也是肿瘤转移的重要机制之一,并与肿瘤干细胞形成和耐药性相关。在原发性肝癌的细胞及动物模型、临床研究中同样发现上皮间质转化现象,且EMT的发生与肝癌复发、转移和化疗耐药相关。Epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)是一个上皮细胞失去上皮特性同时获得间质特性,并且具有运动能力的生物学过程,目前认为EMT与肿瘤转移初始阶段有关。Gregory等的研究提示micro RNA-200的家族成员(micro RNA-200a/b/c,micro RNA-141和micro RNA-492)及micro RNA-205的表达水平在TGF-β诱导的EMT过程中显著降低,提示micro RNA可能调控EMT现象。后续研究中发现,micro RNA-200家族及micro RNA-205可以起始EMT转换过程,提示micro RNA在EMT的调控中起重要作用。而最新的研究表明EMT转换同样可以导致肿瘤细胞对化疗或靶向药物的耐药,Ceppi等研究就发现对西妥昔单抗和顺铂耐药的肺癌细胞中,间质细胞相关的蛋白表达量显著增高,EMT现象特征十分明显,而micro RNA-200c的过表达则可以部分恢复细胞对顺铂的敏感并减低其侵袭能力。微小RNA(microRNA,miRNA)为一类高度保守的、长度通常为20-24个核苷酸的非编码单链小RNA,近年来的研究表明,micro RNA和肝癌的发生、发展、转移密切相关。本研究基于60例临床肝癌组织标本(30例复发,30例原发样本)的micro RNA表达谱分析,探究与EMT,复发转移相关的micro RNAs功能,特别是mi RNA-489在肝癌的EMT转换和复发、转移及mi RNA-205在肝癌干细胞特性的维持作用,进一步确定其关键功能靶标和下游信号调控网络,深入了解HCC的EMT转换和干细胞形成和维持的分子机制,为肝癌提供新的预后标志物和基于mi RNA的肝癌治疗策略具有至关重要的临床意义。第一部分微小RNA(micro RNA)在肝癌复发和细胞上皮-间质转换(EMT)中的作用[目的]本部分研究旨在进一步采用micro RNA表达谱分析和实时定量荧光PCR分析复发与非复发的肝癌临床组织及相关细胞株,挑选和鉴定可能与原发性肝癌复发与转移相关micro RNAs。[方法]1.收集临床上复发和非复发的肝癌组织样本,结合一系列肝癌细胞系,利用micro RNA表达谱芯片技术(Gene Chip micro RNA 2.0 Array,affymetrix),检测相关样品的micro RNAs表达图谱,并比较其差异。2.为了进一步验证芯片结果的可靠性,利用mi R-q RT-PCR定量PCR试剂盒(Applied Biosystem),以U6作为内参,对差异表达的micro RNA进行实时定量PCR验证。3.mi RNA-489在肝癌复发组织中差异性很高,我们推测mi RNA-489可能参与肝癌的复发;使用生物信息软件,我们寻找mi RNA-489在基因组中的定位及靶点。4.mi RNA-205因表达差异及在干细胞特性维持中的作用,是我们重点研究的mi RNA之一,使用生物信息软件,我们寻找mi RNA-205在基因组中的定位及靶点。[结果]1.Agilent human mi RNA芯片V12.0证实和亲本肝癌细胞相比,复发的肝癌细胞有30个表达差异的mi RNA,其中mi RNA-489在复发肝癌细胞中高表达,是原来肝癌细胞组织的12倍。2.RT-PCR验证miRNA的表达,miRNA-489、miRNA-34a、miRNA-21和miRNA-7在复发肝癌细胞组织中高表达,上调12.3、5.2、3.1、2.2倍,而mi RNA-205、mi RNA-145、mi RNA-452、mi RNA-125a-3p等在复发细胞中低表达,分别下调16、14、7.1、6.5倍,结果和芯片结果一致,验证了芯片结果。[结论]本研究证实mi R-489及mi R-205可能参与肝癌复发与转移,其机制可能涉及EMT转换及干细胞特性的维持。第二部分mi RNA-489在肝癌细胞复发、转移及EMT转换中的可能机制[目的]本部分旨在阐明mi RNA-489参与肝癌细胞复发、转移及EMT转换中的可能机制。[方法]1.mi RNA-489在复发肝癌细胞株中高表达(为亲本肝癌细胞株的12倍左右),我们推测mi RNA-489可能参与肝癌细胞复发、转移;使用生物信息软件,结合micro RNA数据库Miranda(www.microrna.org/microma/home.do),mi RBASE(www.mirbase.org)和Target Scan(http://www.targetscan.org/)及Pic Tar(http://pictar.bio.nyu.edu)等,我们寻找mi RNA-489潜在的靶点。2.micro RNA通过和靶基因的3’UTR段相结合而发挥调控作用,我们构建了Smad3 3’UTR段的wild-type和mutant的载体。3.使用dual-luciferase荧光报告系统,以证明在细胞内mi RNA-489是否可以和Smad3结合。4.转染mi RNA-489表达质粒,在低表达mi RNA-489的肝癌细胞株中高表达mi RNA-489后,检测相关细胞通路的蛋白的表达及EMT转换。[结果]1.结合生物信息软件,我们证实了Smad3是mi RNA-489下游作用靶点之一。2.成功构建了Smad3 3’UTR段的wild-type和mutant的载体。3.发现质粒转染至细胞内后,Smad3 3’UTR突变的(mutant)的质粒因与mi RNA-489不能结合,其荧光强度高,而Smad3 3’UTR野生型的(wild-type)的质粒因为能与mi RNA-489结合,导致其在细胞内复制受阻,其荧光强度减低了约60%,其荧光强度值之比具有统计学意义(P<0.05)。4.在上皮型的肝癌细胞中,mi RNA-489低表达,而高表达mi RNA-489后,细胞向间质型转换。5.在间质型肝癌细胞中,mi RNA-489高表达,而低表达mi RNA-489后,细胞向上皮型转换。[结论]本研究证实在体外,mi RNA-489通过调节Smad3通路,参与调节肝癌细胞EMT转换,从而促进肝癌细胞的复发和转移。第三部分mi RNA-205在肝癌细胞干细胞特性维持中的作用和可能机制[目的]本部分旨在阐明mi RNA-205在维持肝癌干细胞特性中的作用及可能机制。[方法]1.mi RNA-205可能参与肝癌干细胞特性的维持;使用生物信息软件,结合micro RNA数据库Miranda(www.microrna.org/microma/home.do),mi RBASE(www.mirbase.org)和Target Scan(http://www.targetscan.org/)及Pic Tar(http://pictar.bio.nyu.edu)等,我们寻找mi RNA-205潜在的靶点。2.micro RNA通过和靶基因的3’UTR段相结合而发挥调控作用,我们构建了PLCβ-1 3’UTR段的wild-type和mutant的载体。3.使用dual-luciferase荧光报告系统,以证明在细胞内miRNA-205是否可以和PLCβ-1结合。4.mi RNA-205结合PLCβ-1可以上调CD24+维持肝癌干细胞特性。[结果]1.结合生物信息软件,我们证实了PLCβ-1是mi R-205下游作用靶点之一。2.成功构建了PLCβ-1 3’UTR段的wild-type和mutant的载体。3.发现质粒转染至细胞内后,PLCβ-1 3’UTR突变的(mutant)的质粒因与micro RNA-205不能结合,其荧光强度高,而PLCβ-1 3’UTR野生型(wild-type)的质粒因为能与micro RNA-205结合,导致其在细胞内复制受阻,其荧光强度减低了约40%,其荧光强度值之比具有统计学意义(P<0.05)。4.在肝癌细胞中mi RNA-205低表达,而高表达mi RNA-205后,干细胞形成能力减弱。[结论]本研究证实mi R-205通过调节PLCβ-1及上调CD24+维持肝癌细胞干细胞特性。