论文部分内容阅读
目的:探讨黄连素通过MAPK信号通路途径对AGEs诱导的人主动脉血管平滑肌细胞钙化的影响及机制。本实验主要通过体外实验方法验证黄连素是否抑制AGEs诱导的HASMCs钙化,进一步验证AGEs是否通过激活ERK1/2、P38、JNK MAPK信号通路促进HASMCs钙化,并探究黄连素是否具有下调ERK1/2、P38、JNK MAPK信号通路作用,为未来寻找临床治疗药物作用新靶点提供新的理论依据。方法:(1)培育4-10代人主动脉血管平滑肌细胞,动态观察细胞形态并应用免疫荧光方法进行细胞鉴定;(2)运用CCK-8法测定不同浓度黄连素对HASMCs存活率影响,以小于IC50(细胞半抑制浓度)为标准,确定黄连素适宜浓度(10、25、50μM/L)。利用AGEs建立人主动脉血管平滑肌细胞钙化模型,即AGEs-BSA(100mg/L)干预7天,并分别予以不同浓度(10、25、50μM/L)黄连素同时干预7天,随后提取细胞总蛋白,Western Blot检测各组细胞OPG、BMP2、OPN蛋白表达量。用Von Kossa染色、茜素红染色观察细胞钙化程度,染色鉴定时AGEs-BSA(100mg/L)干预14天。细胞内钙含量试剂盒测定钙含量,ELISA测定HASMCs内ALP活性。用免疫荧光法观察各组细胞内α-SMA、F-actin、Runx2表达差异。实验分组如下:对照组、β-GP组、DMSO组、AGEs组、AGEs+(10、25、50)μM/LBBR组。(3)第一部分,应用ERK1/2 MAPK特异性抑制剂PD98059,P38 MAPK特异性抑制剂SB203580,JNK MAPK特异性抑制剂SP600125处理HASMCs 15min后提取细胞总蛋白,Western Blot检测各组细胞P-ERK1/2、ERK1/2、P-P38、P38、P-JNK、JNK蛋白表达量;为验证ERK1/2、P38、JNK MAPK信号通路对HASMCs钙化影响及不同浓度黄连素对AGEs诱导的磷酸化MAPK信号通路表达量影响。实验分组如下:对照组、100mg/L AGEs、100mg/L AGEs+(10、25、50)μM/LBBR。第二部分,验证抑制MAPK信号通路对AGEs诱导的HASMCs钙化影响,应用抑制剂(PD98059、SB203580、SP600125)预处理HASMCs 6小时后,加入100mg/L AGEs干预7天后提取细胞总蛋白,Western Blot检测各组细胞OPG、BMP2、OPN表达量;用Von Kossa染色、茜素红染色观察细胞钙化程度,染色检测AGEs-BSA(100mg/L)干预14天。细胞内钙含量试剂盒测定钙含量,ELISA测定HASMCs内ALP活性。用免疫荧光法观察各组细胞内Runx2表达差异。实验分组如下:对照组、DMSO组、PD98059组、SB203580组、SP600125组、AGEs组、AGEs+(50μM/L)BBR组、AGEs+PD98059组、AGEs+SB203580组、AGEs+SP600125组、AGEs+PD98059+(50μM/L)BBR组、AGEs+SB203580+(50μM/L)BBR组、AGEs+SP600125+(50μM/L)BBR组。(4)探索下游因子ATF4在AGEs诱导的HASMCs钙化中的作用以及MAPK与ATF4因子之间关系。加入ATF4 si RNA于HASMCs干预24h后,再加入100mg/L AGEs干预7天,Western Blot检测各组细胞OPG、BMP2、OPN表达量。Western Blot检测P-ERK1/2、ERK1/2、P-P38、P38、P-JNK、JNK蛋白表达量。结果:1、经过HASMCs专用培养基培养2d观察,HASMCs紧贴培养板生长,呈梭形,具有典型“波峰波谷”形态,通过激光共聚焦显微镜可见,细胞经染色处理后,绿色荧光染色为HASMCs特异表型蛋白α-SMA。2、黄连素作用HASMCs192h(8天)时IC50=129.32μM/L,因此选择黄连素浓度梯度为10、25、50μM/L,连续作用时间7天。3、黄连素能抑制AGEs诱导的血管平滑肌细胞钙化,且呈浓度依赖性。AGEs组细胞内钙含量、ALP活性较对照组明显增多(P<0.01),相较于AGEs组,不同浓度黄连素呈浓度依赖性减少人主动脉血管平滑肌细胞钙含量、ALP活性(P<0.01);AGEs组细胞内OPG、BMP2、OPN表达量较对照组明显增多(P<0.01),相较于AGEs组,不同浓度黄连素呈浓度依赖性减少人主动脉血管平滑肌细胞内OPG、BMP2、OPN表达量(P<0.01)。AGEs组冯库萨、茜素红染色钙化程度较对照组增强,而不同浓度黄连素呈浓度依赖性减少人主动脉血管平滑肌细胞钙化程度。AGEs组F-actin荧光强度加强、α-SMA荧光强度减弱,不同浓度黄连素可缓解F-actin荧光强度增强及α-SMA荧光强度减弱。4、AGEs可激活ERK1/2、P38、JNK MAPK信号通路,而黄连素可抑制这一作用。ERK1/2、P38 MAPK参与AGEs诱导HASMCs钙化过程,而JNK MAPK对AGEs诱导HASMCs钙化过程无显著作用。ERK1/2、P38 MAPK抑制剂组(PD98059,SB203580)钙含量、ALP活性较AGEs组明显减少(P<0.01),JNK MAPK抑制剂组(SP600125)钙含量、ALP活性较AGEs组无明显差异(P>0.05)。AGEs组OPG、BMP2、OPN、P-ERK1/2、P-P38、P-JNK蛋白表达量较对照组明显增高(P<0.01),而不同浓度黄连素呈浓度依赖性地下调人主动脉血管平滑肌细胞OPG、BMP2、OPN、P-ERK1/2、P-P38、P-JNK蛋白表达量(P<0.01)。ERK1/2、P38 MAPK抑制剂组(PD98059,SB203580)OPG、BMP2、OPN蛋白表达量较AGEs组明显减少(P<0.01),JNK MAPK抑制剂组(SP600125)OPG、BMP2、OPN蛋白表达量较AGEs组明显无明显差异(P>0.05)。ERK1/2、P38 MAPK抑制剂组(PD98059,SB203580)钙化程度较AGEs组明显减弱,JNK MAPK抑制剂组(SP600125)较AGEs组无明显差异。5、ATF4因子参与AGEs诱导的HASMCs钙化,可能为ERK1/2、P38 MAPK共同下游因子。AGEs+si ATF4组较AGEs组OPG、BMP2、OPN蛋白表达量明显减少(P<0.01),ERK1/2、P38 MAPK抑制剂组(PD98059,SB203580)ATF4蛋白表达量较AGEs组明显减少(P<0.01),JNK MAPK抑制剂组(SP600125)较AGEs组无明显差异(P>0.05)。si ATF4组P-ERK1/2、P-P38、P-JNK、ERK1/2、P38、JNK较对照组无明显减少(P>0.05)。结论:1、黄连素抑制AGEs诱导的人主动脉血管平滑肌细胞钙化。2、ERK1/2、P38 MAPK参与AGEs诱导HASMCs钙化过程,而JNK MAPK对AGEs诱导HASMCs钙化过程无明显作用。3、黄连素抑制AGEs诱导的HASMCs钙化机制可能与通过下调AGEs激活的ERK1/2,P38 MAPK信号通路相关,其作用可能与减少成骨分化蛋白OPG、OPN、BMP2表达有关。4、ATF4参与AGEs诱导的HASMCs钙化,ATF4可能为ERK1/2,P38 MAPK信号通路下游因子,黄连素抑制ATF4表达可能与抑制AGEs诱导HASMCs钙化相关。