【摘 要】
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巴斯德毕赤酵母表达系统经过近三十年的发展,已成为可以生产多种外源蛋白的高效表达系统之一。毕赤酵母表达系统中,应用最广泛的启动子为乙醇氧化酶Ⅰ基因启动子(PAOX1),由于该启动子需要甲醇诱导,从而限制了所表达的外源蛋白在食品,医药等行业上的应用。此外,在利用PAOX1控制外源蛋白表达的系统中,发酵过程一般分为二个阶段:甘油补料期和甲醇诱导期。由于甘油补料期甘油的存在阻遏了PAOX1,从而使得该阶段
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巴斯德毕赤酵母表达系统经过近三十年的发展,已成为可以生产多种外源蛋白的高效表达系统之一。毕赤酵母表达系统中,应用最广泛的启动子为乙醇氧化酶Ⅰ基因启动子(PAOX1),由于该启动子需要甲醇诱导,从而限制了所表达的外源蛋白在食品,医药等行业上的应用。此外,在利用PAOX1控制外源蛋白表达的系统中,发酵过程一般分为二个阶段:甘油补料期和甲醇诱导期。由于甘油补料期甘油的存在阻遏了PAOX1,从而使得该阶段的外源蛋白表达量极其低。因此在工业上增加南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）的表达量也成为必要。本研究利用毕赤酵母中组成型启动子—翻译延伸因子1-α启动子(PTEF1),在以甘油为碳源的培养基中对表达CALB进行了初步的探索。同时,为了满足工业上的需要,采用PTEF1和PAOX1联合控制CALB表达系统,对增加CALB在甘油补料期的表达量进行了初步的探索,具体结果如下: 1.从本实验室保藏的质粒pICAS-CALB中克隆出CALB,构建分泌表达载体pAOX9K-CALB。从毕赤酵母基因组GS115中克隆PTEF1,以PTEF1替换毕赤酵母表达载体pAOX9K-CALB中的PAOX1,得到重组质粒pTEF9K-CALB,转化毕赤酵母GS115后在组氨酸营养缺陷型MD平板上获得重组酵母GS115/pTEF9K-CALB。并通过与用相同方法构建的重组菌GS115/pGAP9K-CALB相比,发现PTEF1更适合于应用于表达CALB。摇瓶培养下,重组菌GS115/pTEF9K-CALB发酵72小时后发酵液中酶活,达到32U/mL;通过50L发酵罐碳源流加补料,重组菌GS115/pTEF9K-CALB发酵79h后发酵液中酶活,最高达到285U/mL,这说明PTEF1是一个高强度的组成型启动子,利用该启动子可以扩大外源蛋白在食品,医药等行业上的应用。 2.构建了重组载体pPICZαA-CALB,转入重组毕赤酵母pTEF9K-CALB,在含博莱霉素（zeocin）的平板上获得由组成型启动子和诱导型的启动子(PAOX1,PTEF1)控制CALB表达的重组酵母菌（GTA）。摇瓶培养下,重组菌GTA发酵72小时后发酵液中酶活,达到46.5U/mL。通过50L发酵罐碳源流加补料,重组菌GTA诱导96h后发酵液中酶活,最高达到560U/mL,比在相同培养条件下重组菌GS115/pAOX9K-CALB（GA）发酵液中的酶活,要高50%左右,这说明采用双启动子(PAOX1,PTEF1)控制系统,为将来提高其它外源蛋白在毕赤酵母中的表达量提供了一个模型。
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