实验一 目的：分离培养尼罗罗非鱼精巢支持细胞(Sertoli Cells，SCs)，探讨不同添加物对尼罗罗非鱼精巢支持细胞生长增殖的影响。 方法：无菌取发育至第III期的尼罗罗非鱼精巢，PBS清洗后，剪碎精巢组织，0.25％胰蛋白酶消化，用含10％犊牛血清(new bovine serum，NBS)的L-15培养液终止消化，过滤，离心，获得细胞。用含10％NBS的L-15培养液稀释细胞后，将细胞培养在铺有明胶的培养瓶中，并依据SCs比生殖细胞贴壁速度快的特性，筛选SCs。在26℃、无CO2饱和湿度恒温培养箱中，用含10％NBS的L-15培养液培养SCs。甲基绿染色。倒置显微镜下，观察SCs的形态。生长良好的SCs培养在96孔板中，分别采用含10％NBS的L-15、M199、F12培养液，含5％、10％、15％NBS的L-15培养液，含1％罗非鱼血清的L-15+10％NBS培养液培养尼罗罗非鱼SCs。各组每2d取6孔细胞，血球计数板计细胞数，绘制SCs生长曲线。 结果：胰蛋白酶消化分离精巢组织，L-15+10％NBS培养液培养，获得尼罗罗非鱼SCs。培养1～2d，SCs开始贴壁并极化；培养3～5d，细胞完全贴壁并迅速增殖。开始贴壁生长时，SCs呈长柱状或三角形。单个SCs呈不规则多边形，核位于胞质中央，呈卵圆形，胞质中可见吞噬颗粒和空泡，空泡聚集于支持细胞胞质的两极或散布于核的四周。SCs在L-15培养液中贴壁生长，在F12、M199培养基中较难贴壁。与F12、M199培养液相比，L-15培养液更有助于尼罗罗非鱼SCs生长增殖(P<0.01)。与添加5％NBS、15％NBS相比，在L-15培养中添加10％NBS更有助于尼罗罗非鱼SCs生长增殖(P<0.05)。与无尼罗罗非鱼血清相比，在10NBS+L-15培养中添加1％尼罗罗非鱼血清能显著促进SCs生长增殖(P<0.05)。 结论：采用胰酶消化、10％NBS+L-15培养液培养，获得尼罗罗非鱼精巢支持细胞；采用10％NBS+1％罗非鱼血清+L-15培养液培养，能显著促进尼罗罗非鱼精巢支持细胞生长增殖。 实验二 目的：分离、培养、鉴定尼罗罗非鱼精原干细胞(spermatogonial stemcells，SSCs)，探讨不同添加物对尼罗罗非鱼精原干细胞生长增殖的影响。 方法：无菌取发育第III期以内的尼罗罗非鱼精巢，PBS清洗后，剪碎精巢组织，0.5mg/L胶原酶消化30min后，未完全消化精巢组织块用0.25％胰蛋白酶-EDTA继续消化5min，用含10％NBS的L-15培养液终止消化，离心，收集细胞。用含10％NBS的L-15培养液悬浮细胞，并依据SSCs比支持细胞贴壁速度慢的特性，筛选尼罗罗非鱼SSCs。在26℃、无CO2饱和湿度恒温培养箱中，用含5％NBS+10ng/mlLIF+1％罗非鱼血清的L-15培养液培养尼罗罗非鱼SSCs。采用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AKP)染色和体外分化实验对分离培养的尼罗罗非鱼SSCs进行鉴定。在有支持细胞饲养层和无饲养层的条件下，培养尼罗罗非鱼SSCs，测定SSCs分裂指数。在有支持细胞饲养层的条件下，分别采用添加2％、5％、10％NBS的L-15培养液，添加1％、2％、3％罗非鱼血清的L-15+5％NBS培养液，添加5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL白血病抑制因子(leukemia.inhibitor factor，LIF)的L-15+5％NBS+1％罗非鱼血清培养液培养尼罗罗非鱼SSCs，比较不同添加物对尼罗罗非鱼SSCs生长增殖的影响。 结果：SSCs贴壁时间为1～3d，3d后细胞开始分裂增殖。SSCs培养约10d可形成数十个SSCs克隆，AKP染色阳性。在无支持细胞饲养层、培养液不添加LIF的条件下，长期培养，少数SSCs可分化形成类神经元样细胞。在有支持细胞饲养层时，SSCs分裂指数明显高于无饲养层培养的SSCs，支持细胞饲养层明显促进精原干细胞分裂增殖(P<0.01)。与添加2％、10％NBS相比，添加5％NBS能显著促进精原干细胞生长增殖(P<0.01)。添加1％、2％、3％尼罗罗非鱼血清对SSCs没有显著的促生长增殖作用。添加5ng/mL、10ng/mLLIF可促进SSCs增殖，添加15ng/mLLIF则抑制SSCs增殖，添加10ng/mLLIF更有助于SSCs生长增殖。 结论：采用胶原酶、胰蛋白酶-EDTA两步消化，5％NBS+10ng/mL LIF+1％罗非鱼血清+L-15培养液培养，获得尼罗罗非鱼精原干细胞；使用尼罗罗非鱼精巢支持细胞作饲养层，5％NBS+10ng/mL LIF+L-15培养液培养，有助于促进尼罗罗非鱼精原干细胞生长增殖。