滨蒿内酯通过TLR-4/NF-κB信号通路抑制炎症反应减轻肝纤维化机制研究

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目的:探究滨蒿内酯(Scoparone,SCO)体内外抗肝纤维化作用,讨论TLR-4/NF-κB在SCO抑制肝纤维化发生发展过程中的作用机制,寻求治疗肝纤维化新的作用靶点与思路。方法:采用CCl4和转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)成功建立肝纤维化的大鼠体内和肝星状细胞(Hepatic stellate cell-T6,HSC-T6)体外模型。在体内实验中,我们选用雄性SD大鼠60只,分为6组,分别为正常组,模型组,秋水仙碱组(0.12mg/kg),SCO高,中,低剂量组(200,100,50 mg/kg)。HE染色观察肝损伤及纤维化程度,生化法检测大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl transpeptidase,γ-GT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性水平;微板法检测血清中总胆红素(Total bilirubin,TBIL)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测血清中胶原沉积因子透明质酸(Hyaluronic acid,HA)、层粘连蛋白(Laminin,LN)、III型前胶原(Procollagen-III,PC-III)和IV型胶原(Collagen type IV,IV-C)的表达水平;ELISA检测血清中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)含量;蛋白质印迹法(Western Blot,WB)及实时荧光定量聚合酶链锁反应(Quantitative real-time PCR,Q-PCR)检测TLR-4/NF-κB通路中相关蛋白和mi RNA表达情况。在体外实验中,大鼠肝星状细胞(HSC-T6)被分为正常组、模型组(TGF-β1 10 ng/m L)和SCO高,中,低剂量组(80,60,40μM),免疫荧光实验观察HSC-T6经TGF-β1诱导后α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及NF-κB蛋白的表达情况;划痕检测给药后细胞迁移状况;WB和Q-PCR检测给药后HSC-T6细胞中TLR-4/NF-κB通路相关蛋白和mi RNA表达情况。结果:(1)SCO对CCl4导致的肝纤维化SD大鼠有保护作用,当给药浓度为200 mg/kg时,保护作用最佳。(2)SCO可降低肝纤维化大鼠TLR-4/NF-κB通路中的TLR-4,My D88、p-NF-κB蛋白表达,并且显著减少该通路下游因子TNF-α,IL-6,IL-1β的含量。(3)SCO可以抑制由TGF-β1活化的HSC-T6细胞增殖,其IC50为60.12μM。(4)SCO可降低HSC-T6细胞中TLR-4/NF-κB通路的TLR-4,My D88、p-NF-κB蛋白表达,并且显著降低该通路下游因子TNF-α,IL-6,IL-1β的含量。(5)SCO抑制体内外TLR-4/NF-κB通路后,肝纤维化相关蛋白α-SMA、TGF-β1表达显著降低。结论:SCO能够阻断体内外TLR-4/NF-κB通路发挥抗肝纤维化作用。
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