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实验目的子宫内膜作为性激素作用的靶器官,在女性生理的研究中占有重要地位。由于原代培养的子宫内膜腺上皮细胞在体外培养的时间十分有限,从而阻碍了对细胞的生长、分化和代谢以及性激素作用机制的研究,故需要一个能够在体外长期培养,适合各种不同实验研究目的的细胞模型。建立HPV16E6、E7基因转染的人子宫内膜腺上皮永生化细胞系,以促进对子宫内膜腺上皮细胞的细胞生物学、分子生物学、生长分化调节和恶性转化机制等方面的研究。材料与方法一、实验材料:1、材料来源选择2006年10月至2007年6月在中国医科大学附属盛京医院门诊宫腔镜因不孕行输卵管通水的患者5例,及因子宫肌瘤行全子宫切的患者5例,月经周期规律,手术时为子宫内膜增殖末期,取其子宫内膜组织行实验研究。2、细胞系、质粒及菌株PMD20-T载体购自大连宝生物公司,pcDNA3.1（+）真核表达载体由中国医科大学发育生物学陈澄教授馈赠,大肠杆菌JM109中国医科大学设备处保存。3、试剂超纯质粒提取试剂盒,质粒转染试剂盒,G418,鼠抗人细胞角蛋白19单克隆抗体,鼠抗人HPV16/18 E6单克隆抗体,鼠抗人HPV16 E7单克隆抗体,DMSO,DMEM,胎牛血清。二、实验方法:1、构建及提取重组质粒pcDNA3.1（+）/HPV16E6E7:按超纯质粒提取试剂盒说明书提取质粒。分光光度仪检测DNA浓度。2、重组质粒转染原代培养的子宫内膜腺上皮细胞及抗性克隆的筛选:利用转染试剂盒将质粒pcDNA3.1（+）/HPV16E6E7转入腺上皮细胞中。G418筛选阳性克隆。3、RT-PCR检测细胞内HPV16E6/E7 mRNA的表达。4、Western Blot检测目的基因在蛋白水平的表达。5、细胞形态学观察:用相差显微镜观察细胞的生长状况及形态变化。6、免疫细胞化学:按照SABC试剂盒说明进行免疫组织化学染色。7、细胞增殖试验:分别采用MTT法和细胞计数法绘制细胞的生长曲线。8、流式细胞仪分析细胞周期:PI染液染色,上机定量分析细胞周期。9、软琼脂培养:细胞接种于双琼脂培养皿中培养2周,观察细胞集落的形成情况。实验结果1、重组质粒pcDNA3.1（+）/HPV16E6E7的提取。2、PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测HPV16型E6、E7基因的片段长度约800bp。3、HPV16E6、E7蛋白Western印迹检测:转化后子宫内膜腺上皮细胞HPV16E6、E7蛋白阳性表达。4、形态学观察:永生化细胞形态无明显改变,相差显微镜下观察细胞贴壁较紧,为多边形或圆形,密集区域呈镶嵌状排列。5、免疫细胞化学:阳性细胞灶胞浆被均染成棕黄色,胞核呈蓝色。6、细胞增殖实验:转化后细胞倍增时间约为52.8小时,对数生长期后细胞停止分裂增生,活性降低,摄取MTT的能力下降。7、流式细胞仪分析:转化后的子宫内膜腺上皮细胞无凋亡峰出现,S期比例为33.23%,明显增加。与未转化细胞相比差异具有统计学意义。8、软琼脂培养:转化细胞在软琼脂中培养未见有集落形成;对照组有集落形成。结论1、转染HPV16E6、E7基因至体外培养的子宫内膜腺上皮细胞,细胞寿命明延长,得到了可以在体外传代30次以上的转化细胞。2、转化细胞既具有正常细胞的表型和生长特性,又具有强的增殖能力却不具有致瘤性,充分表明:这些转化细胞属介于正常细胞与恶性肿瘤细胞之间的永生化细胞群。