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种植体与骨组织形成骨结合是种植体成功的前提。有研究发现,二氧化钛纳米管阵列可以模拟天然骨组织中胶原纤维的尺寸和排列[1],并且和骨组织的弹性模量很相近,能在种植体植入区吸引和诱导骨髓间充质干细胞的成骨向分化,是一种具有良好促进骨结合能力的纳米级形貌修饰[2]。另有研究发现,静水压力可提高细胞活性,并能促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化和成熟[3];流体流动产生的剪切力可以诱导干细胞早期成骨分化[4,5];循环和间歇性静水压可以促进骨骼发育[3,6,7]。但目前仍然没有先将细胞种植在经纳米修饰的钛植入体表面,然后再给予液体静压力加载的相关研究报告。本研究拟将具有纳米管形貌的钛种植体材料和间歇性液体压力相结合,更真实的模拟骨种植体植入体内后的生物过程,观察种植体周围干细胞的生物学行为,以期为临床上获得更好更快的骨结合提供理论依据。第一部分纳米管形貌钛试件的制备及其表面性能分析【目的】制备具有纳米管形貌的纯钛试件,为后期实验打下基础。【方法】采用物理打磨抛光的方法将医用纯钛制备成表面光滑的纯钛试件;采用阳极氧化的方法在光滑的纯钛试件表面制备出二氧化钛(Ti O2)纳米管;采用场发射扫描电镜(FE-SEM)观察所制备的Ti O2纳米管的完整性、管径的大小和管在纯钛试样表面分布的均匀程度。【结果】成功制备出表面光滑的抛光纯钛试样和表面含有管径一致、分布均匀的Ti O2纳米管结构的试样。【结论】可以通过简单的阳极氧化的方法在光滑钛表面制备出分布均匀、管径约80-100 nm的Ti O2纳米管。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定【目的】体外分离培养并鉴定SD大鼠BMSCs的生物学特性。【方法】通过全骨髓贴壁法体外分离培养鼠BMSCs,并用光学显微镜对其形态进行观察;通过流式细胞仪检测鼠BMSCs的细胞表面标记;通过MTT和克隆形成检测鼠BMSCs的自我更新能力;通过体外成骨和成脂诱导分化实验检测鼠BMSCs的多向分化潜能。【结果】体外分离培养出的鼠BMSCs在光学显微镜下呈长梭形、三角形或多角形并阳性表达间充质干细胞的表面标记CD29(97.75%)、阴性表达造血干细胞标记CD45(1.86%)和内皮细胞特异性分子表型CD31(1.07%);BMSCs的成骨染色可见钙化结节;BMSCs的成脂染色观察到脂滴形成;BMSCs的克隆形成能力为10.8%;【结论】采用全骨髓贴壁培养法分离培养出的BMSCs属于间充质来源,具备自我更新、多向分化的潜能。第三部分压力对纳米管表面骨髓间充质干细胞生物学行为的影响【目的】更真实的模拟骨种植体植入体内后的生物过程,观察静压力对钛纳米管表面的BMSCs行为的影响,为临床上获得更好更快的骨结合提供理论依据。【方法】体外分离培养大鼠BMSCs并将其分别接种于纯钛抛光(PT组)和Ti O2纳米管(NT组)试件表面;常规培养24h后,将每组试件按照加载压力(0kpa、13kpa、68kpa、120kpa)的不同随机分组,并置于细胞液压加载装置中分别给予细胞1h/d不同静压力的刺激;用CCK-8检测各组细胞的增殖能力;免疫荧光染色和FE-SEM分别观察各组细胞的骨架和形态;流式细胞术检测细胞凋亡;采用茜素红染色法来检测ECM矿化;ALP试剂盒检测各组细胞的ALP活性;天狼星红染色法来检测细胞COL分泌。【结果】(1)加力(13kpa、68kpa、120kpa)没有造成显著的细胞凋亡。(2)与不加力组相比加力培养4d可促进BMSCs的增殖;纳米形貌和力学刺激共同作用时7-14d时,虽BMSCs的增殖低于对照组(P<0.05),但其伪足的伸展、F-actin、ALP的表达量、均较对照组明显升高,且能明显促进以胶原分泌和ECM矿化为代表的BMSCs成骨向分化。【结论】纳米形貌和液体静压力可协同影响BMSCs的增殖、细胞形态及分化。