论文部分内容阅读
为研究封闭式拉长细管(closed pulled straw, CPS)能否用于冷冻牛卵母细胞。本试验分别探讨了表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)对牛卵母细胞体外成熟及共培养方式对胚胎发育的影响、最佳卵母细胞玻璃化冷冻液的选择、不同发育阶段对牛卵母细胞玻璃化冷冻的影响和CPS冷冻牛卵母细胞的研究。研究结果如下:1分别将牛卵母细胞用含有不同浓度EGF的成熟液进行成熟培养,并根据成熟率分析EGF的最适浓度;将受精胚胎用不同的共培养体系进行培养,根据胚胎发育率分析两种共培养体系对胚胎发育的影响。结果表明,EGF含量为15和20 ng/mL两组的发育率显著高于其他几个组(P<0.05);两种共培养体系中的胚胎发育率无显著差异(P>0.05)。结论:牛卵母细胞成熟培养时,当培养液中EGF含量为15-20 ng/mL时成熟效果可达到最好;颗粒细胞和成纤维细胞两种共培养方法对胚胎发育的影响无显著差异。因此,试验中可以根据实际条件来选择不同种类的细胞来进行共培养。2将成熟牛卵母细胞分别用四种冷冻液进行冷冻,解冻后进行体外受精,并根据胚胎发育率确定最佳冷冻液。结果表明,冷冻液浓度为20%EG + 20%DMSO组的胚胎发育率显著高于其它几个组(P<0.05)。结论:将20%的EG和20%的DMSO共同使用,做为冷冻保护剂加入到玻璃化冷冻液中,可以使冷冻效果达到最佳。3将牛卵母细胞分别成熟培养不同的时间后进行冷冻,解冻后培养至成熟并进行体外受精,根据胚胎发育率确定牛卵母细胞最佳冷冻时期。成熟培养22h的牛卵母细胞玻璃化冷冻,解冻并体外受精后其成熟率、卵裂率和囊胚率分别为77.2%、56.5%和16.9%,显著高于其他几个成熟时期的牛卵母细胞发育率。结论:牛卵母细胞体外培养22h时,其生理状况基本达到成熟,并且受精前需在成熟液中继续培养2h,有利于冷冻保护剂的充分脱出,玻璃化冷冻的效果更好。4将GV期牛卵母细胞分别采用细管、开放式拉长细管(open pulled straw, OPS)和CPS三种方法进行冷冻,解冻后进行体外成熟和体外受精,根据胚胎发育率对比三种方法的差异。结果表明:细管组、OPS组和CPS组卵母细胞的正常形态率分别为67.1%、88.1%和85.8%,成熟率分别为49.1%、66.9%和64.4%,卵裂率分别为19.6%、45.8%和43.4%,囊胚率分别为0、6.6%和6.0%,OPS和CPS两组间上述指标差异均不显著(P>0.05),但均高于细管组,且差异极显著(P<0.01)。结论:CPS法既具有OPS法快速降温的优点,同时,还能避免卵母细胞和液氮直接接触,降低卵母细胞通过液氮被污染的风险。因此,CPS冷冻法可以用于牛卵母细胞的冷冻。