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在前期研究工作的基础上,对本实验室所获得的ACO基因序列进一步的研究,分析与其它物种所得到的序列相似性关系,进行该基因序列的原核表达和分析其蛋白的表达。本实验取得的结果如下:
1.亚洲百合‘Polyarma’ACO基因eDNA.全长克隆及序列分析在本实验室已经得到百合ACO基因片断设计一对末端扩增的特异引物,采用RACE方法,克隆获得了亚洲百合‘Polyaana’ACO基因的完整eDNA序列,长1152 bp。该序列有954 bp的开放阅读框,编码318个氨基酸。暂命名为LACO。序列登录到GenBank数据库,登录号为:EU296623。序列比对表明,LACO核苷酸序列与其它植物已报道的ACO基因具有71%-82%的相似性,氨基酸序列有70%-87%的相似性。
2.亚洲百合‘Polyanna’ACO基因DNA克隆及序列分析以亚洲百合‘Polyanna’DNA为模板,根据已得到的完整开放阅读框区域设计引物,克隆得到了LACO的部分DNA.序列,长972 bp,分析发现在开放阅读框内没有内含子。
3.亚洲百合‘Polyanna’ACO基因的原核表达载体构建、表达、重组蛋白的纯化。
构建了ACO基因原核表达的载体pGEX-ACO,根据序列分析表明,目的基因按正确的阅读框架插入到表达载体中。筛选出阳性重组载体,用0.4 m MIPTG分别在20℃、25℃、28℃、30℃、33℃和37℃诱导,表达产物通过12%SDS-PAGE分析,证明ACO基因在大肠杆菌中成功得到了表达,表达产物的分子量为61kDa,经过表达条件的优化后,得到了含量比较高的可溶性融合蛋白。该可溶性融合蛋白通过GST亲和树脂纯化,得到了单一的融合蛋白条带。以目的融合蛋白作为抗原免疫成年家兔,获得抗血清。