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本研究通过建立多年生黑麦草(Lolium perenne L.)高频再生体系,应用基因枪和农杆菌介导法将DREB1A和BADH-CMO基因导入胚性愈伤组织,获得正常生长的抗性增强的可育转基因植株;通过人工授粉和自由杂交方式获得转基因子代,并研究了其萌发、盆栽和田间生长特性;建立了快速检测多年生黑麦草转基因植株潮霉素(hyg)抗性的方法和抗旱子代筛选体系;综合评价了转基因多年生黑麦草的安全性。通过5年多的研究,在以下几个方面取得了进展:1、选择适宜品种,以胚为外植体,建立多年生黑麦草高频再生体系,使愈伤诱导率达到97.9%,胚性愈伤率达到19.4%,分化率可达90.9%。2、建立起多年生黑麦草遗传转化筛选系统:愈伤培养阶段添加hyg 100mg/L,筛选30d;植株再生阶段50mg/L,筛选至有芽长出后移入不含hyg的生根培养基中。农杆菌介导转化时以头孢霉素(cef)为抑菌剂,愈伤培养阶段添加300mg/L,植株再生阶段250mg/L。3、建立多年生黑麦草基因枪遗传转化体系:以0.5～1mm间的胚性愈伤组织为受体,金粉直径1μm,采用Ca(NO3)2+PEG4000作为DNA沉淀剂,6cm高度下轰击2次。获得转DREB1A基因爱神特转基因株系(ATR)68个,特拉华转基因株系(DTR)7个,尤文图斯转基因株系(JTR)18个;转BADH-CMO基因爱神特转基因株系(ABC)15个,三个品种的平均抗性绿苗率为11.1%。4、建立多年生黑麦草农杆菌介导遗传转化体系:以预培养5d的胚性愈伤组织为受体,采用OD600=0.1左右的农杆菌菌液侵染10min,期间进行抽真空和晃动处理。去除菌液后,共培养4d,以500mg/L cef清洗后筛选,获得转DREB1A基因爱神特转基因株系(AGR)14个。5、转基因多年生黑麦草在温室和田间均可正常生长,盆栽ATR、AGR和ABC较ACK生长速度减慢,田间ATR、AGR、JTR、DTR与对照植株无明显差异,但ABC的生长受到严重抑制。外源基因的插入不仅使转基因植株的抽穗时间提前,还导致其穗长变短,尤其是BADH-CMO基因显著降低了ABC的穗长。DREB1A基因使转基因植株的抽穗个数略有提高,而BADH-CMO基因则使其显著降低。转基因植株较对照植株具有更高的抗旱、越冬和耐盐性,但抵御病害的能力明显下降,在对抗虫害方面二者无明显差异。除ABC外,转基因植株均能结实。6、采用人工授粉和隔离杂交两种方式获得大量转基因子代,T1代种子具有较高的发芽势和发芽率。以JTR为父母本的种子的发芽势具明显优势,以AGR为母本的种子的平均发芽势最低,以DTR为父本的种子的平均发芽势最低。T1代7天的平均芽长和根长分别为3.9cm和3.2cm。以JTR为父母本的种子,平均芽长最长,而以AGR为父母本种子,平均芽长最短。田间JTR的子代表现最优,以DCK和ATR-12为母本自由杂交的子代出苗势和出苗率均达100%。自由杂交授粉比人工授粉的种子具有更高的田间出苗势、出苗率、苗高和分蘖数,即使同一母本所得种子的萌发能力也不同。7、hyg和PEG对爱神特种子的萌发具有极显著影响,75mg/L hyg将发芽势降至44.8%,但发芽率仍达61.5%,hyg不适合在萌发期筛选转基因子代。15%的PEG只能使极个别种子发芽,20%则完全不能发芽。以15%的PEG筛选转基因T1代种子,推测的外源基因分离规律均低于孟德尔遗传定律。8、建立快速检测多年生黑麦草转基因植株hyg抗性的方法:1mg/L 6-BA+50mg/L hyg可用于多年生黑麦草离体叶片段的筛选,第8天时的褐化情况可作为初步筛选转基因植株的依据。盆栽T1代经干旱筛选后恢复生长的植株进行hyg叶片筛选,经筛选后的植株进行PCR检测全部呈阳性,初步说明外源基因在植物体内能够稳定遗传。9、转DREB1A和转BADH-CMO基因多年生黑麦草属于安全等级为I级的转基因植物,已经国家林业局生物安全处批准进行中间试验。