钛及其合金已被广泛应用于骨科种植体材料。然而,从临床病例反馈发现感染,无菌性松动和长期慢性炎症等并发症导致了植入体失败。感染中,细菌附着在植入物表面后,分泌胞外多糖形成生物膜,保护它们不被吞噬和抗生素杀灭。钛表面自然形成惰性的二氧化钛薄膜致使其缺乏生物活性,同时炎症导致的纤维囊包裹种植体,从而骨科种植体的骨整合能力差。另外,研究发现植入物的炎症反应是促进血管生成、伤口愈合和调节成骨的关键阶段。对钛表面进行形态学改性可以抑制细菌的粘附,促进细胞的粘附,增殖和分化以及调控炎症反应。银作为天然的广谱抗菌剂不易诱发抗药性,在体内感染模型中银纳米颗粒还可以促进骨修复。因此,我们通过对钛表面进行微纳结构改性并结合银纳米颗粒构建了载银微纳钛表面,以期获得抗菌又促进细胞和组织粘附的功能表面,并探究以巨噬细胞为代表的免疫细胞对其的响应。通过阳极氧化,微弧氧化和酸蚀处理在表面构建了微米结构(AE)、纳米结构(TNT)和微纳复合结构(MNT、AE-TNT和AE-MNT)。阳极氧化(TNT)和微弧氧化(MNT)处理相较于预处理后钛表面PT粗糙度增加。酸蚀处理后钛表面粗糙度达到微米级,AE-TNT和AE-MNT的粗糙度高于AE。随着粗糙度增加亲水性提高,然而MNT因表面为金红石和锐钛矿混合晶型相对疏水。与亲水性和晶型相比,粗糙度对表面吸附的蛋白量起主导作用。微米结构能为细胞提供更多的粘附点和空间保护,不利于预防感染。微纳复合结构和纳米结构能可下调金黄色葡萄球粘附(fnb A和Clf B)和生物膜合成(ica A和ica D)基因表达来抑制细菌粘附。为增加微纳钛表面抵御细菌的能力,采用化学还原法制备粒径10 nm左右的银纳米颗粒(Ag NPs),通过真空吸附到MNT表面,得到载银微纳钛Ag MN。载银微纳钛对成纤维细胞的增殖和铺展无负面作用,在7天时完全覆盖样品表面,表明其无明显细胞毒性。Ag MN可抑制粘附相关基因(fnb A和Clf B),从而抑制细菌粘附。少量粘附细菌与表面Ag NPs相互作用,细菌的细胞膜壁损坏致使细菌死亡。Ag MN还可抑制生物膜生成,从而展示优异的抗菌能力。体内感染模型中,细胞和组织优先于细菌粘附在种植体表面,在植入7天后Ag MN上未见细菌粘附。此外,与MNT相比Ag MN可减少促炎性细胞因子TNF-α和IL-6的分泌,预示着炎症消退,促进伤口愈合。以多巴胺制备Ag NPs,并通过共价键和离子键与钛基底结合,将Ag NPs固定在MNT表面(Ag PD-MNT),减少银的释放(21天释放量为8 ppb)。在细胞毒性实验中,MNT,载多巴胺微纳钛PD-MNT和载银多巴胺微纳钛Ag PD-MNT对细胞的增殖和形貌无显著差异。因此Ag PD-MNT无明显细胞毒性,且具有良好的抗菌性。为探究免疫细胞对改性后钛表面的响应,选取了高度可塑性的巨噬细胞。细胞的增殖和形态学发现MNT、PD-MNT和Ag PD-MNT表面的巨噬细胞在5天内数量增加,7天后发生凋亡。实验结果表明在3天时,样品表面的巨噬细胞极化为M1/M2混合表型,M1型巨噬细胞比例较高。7天时,更多的巨噬细胞发生极化,主要表现为M2型巨噬细胞,愈合相关基因PDGF-BB、TGF-β、BMP2和BMP6的表达上调。由此可见材料在3到7天促进巨噬细胞向M2型转变,促进炎症消退和组织重建。在材料组中,Ag PD-MNT对巨噬细胞极化的调控作用最为显著。Ag PD-MNT诱导粘附巨噬细胞细胞凋亡,调节NF-κB(IκB和IL-1ra)和TLR(Myd88、Ticam1和Ticam2)信号通路级联基因的表达,以及激活自噬来减轻炎症反应。我们比较了MNT、PD-MNT和Ag PD-MNT的体外矿化能力,以及在完全和条件培养基中对间充质干细胞成骨分化的影响。在浸泡模拟体液后,MNT表面有羟基磷灰石形成。PD-MNT和Ag PD-MNT因表面丰富的羟基,增强了与钙离子的螯合作用,体外促矿化能力提高。MNT上调了成骨化标志基因Runx2、ALP、COL-I、OPN和OCN的表达,促进了大鼠间充质干细胞(r BMSCs)向成骨分化。在表面沉积PDA或PDA/Ag NPs后,样品促成骨分化的能力显著提高。从样品与巨噬细胞培养后收集的条件培养基用以培养接种在样品表面的间充质干细胞,培养基中TGF-β和BMP2细胞因子激活了干细胞上TGF-β/BMP/SMADS信号通路,协同材料本身增强了成骨化标志基因表达。Ag PD-MNT的促成骨分化的能力最好。为了进一步模拟间充质干细胞和免疫细胞在体内共存的微环境,考察材料、巨噬细胞和间充质干细胞之间的相互作用,采用Transwell共培养系统。间充质干细胞分泌的细胞因子可以影响对巨噬细胞极化。在3天时,间充质干细胞分泌的TGF-β细胞因子和巨噬细胞对间充质干细胞识别,促进巨噬细胞向促炎M1型极化。7天时,r BMSCs通过分泌的M-CSF,以及其分泌TGF-β与巨噬细胞细胞膜上TGFβ-RⅡ相结合而激活的TGF-β/TGF-βR2通路,诱导巨噬细胞M2型极化。此外,材料和干细胞刺激巨噬细胞分泌的细胞因子通过旁分泌作用促进了r BMSCs向成骨分化。最后,在大鼠股骨内进行植入实验,研究MNT、PD-MNT和Ag PD-MNT在体内在植入早期对炎症反应和后期骨整合的调控。特别是Ag PD-MNT,随着植入时间的增加,种植体附近M2型巨噬细胞的标志物Arg-1的表达和细胞比例增加。由此巨噬细胞表型由M1向M2转变,有利于抑制炎症反应和组织重塑。在2周时,MNT和PD-MNT与宿主组织的界面的纤维层影响了植入后期骨整合。在植入8周后Ag PD-MNT的骨形成率和骨接触率最高,在材料组中骨整合情况最好。综上,载银微纳钛具有优异的抗菌性,骨免疫调节作用,促干细胞成骨分化和骨整合的能力,是一种有前景的骨替代材料。