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目的 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是胰腺癌化疗治疗中应用最早最广泛的药物，但其疗效不佳；据Stephen对晚期胰腺癌患者的观察，5-FU的反应率仅为7％，平均生存时间为4.5个月。NO是生物体内一种简单的自由基，参与各项生理活动，对肿瘤的生长也有重要的影响。近年来，人们在研究中发现NO除了自身的抗肿瘤作用以外，还可以加强肿瘤细胞（包括乳腺癌、黑色素瘤等）对包括5-FU在内的化疗药物的敏感性。NO还是5-FU刺激肿瘤细胞凋亡的效应分子。本实验观察NO在5-FU诱导胰腺癌细胞凋亡过程中的作用。探索胰腺癌的综合治疗方法。 实验材料与方法 1．试剂与仪器 一氧化氮（NO）测定试剂盒、一氧化氮合酶（NOS）测定试剂盒、蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。L-精氨酸和其拮抗剂LNAME（Nω-nitro-L-Arginine methylester）及内毒素（LPS）购自美国Sigma公司。胰蛋白酶、碘化丙啶（PI）、RNA酶、1640培养液、胎牛血清购自上海华美生物工程公司。流式细胞仪和分光光度计在中心实验室，电镜在电镜中心。 2．细胞培养 将人胰腺癌细胞株BXPC-3用含10％的胎牛血清的1640培养液在37℃5％CO2孵箱内培养。 3．测定胰腺癌细胞的一氧化氮合酶（NOS）的活力 取96孔板各孔按照分组加入药物培养液。每组分为3个复孔。对照组：生长液。实验组：含100mg／L 5-FU的药物培养液。加药后培养24小时，取上清液加入试剂盒内的各种药物后在分光光度计530nm，1cm光径进行测定，其结果按照公式计算出NOS活力。 4．细胞上清液中NO含量的测定 采用硝酸还原酶法测定NO的含量。取24孔板各孔按照分组加人药物培养液。每组分为6个复孔。加药后培养24小时，取上清液加人试剂盒内的各种药物后在分光光度计550nm，0.scm光径进行测定，其结果按照公式计算出NO含量。 5.流式细胞仪进行凋亡细胞的测定 采用碘化丙吮（PI）染色，取一个24孔板各孔按照分组加人药物培养液。每组分为6个复孔。加药后培养24小时，用0.25%胰蛋白酶将细胞从培养板上消化下来，PI染色后上流式细胞仪分析。 6.电镜观察 在培养瓶中将胰腺癌细胞培养至对数生长期，按分组加药。加药后培养24小时，用0.25%的胰蛋白酶将细胞消化下来，常规电镜样品制备后，投射电镜进行观察。 7.统计方法 采用方差分析，t检验进行统计学分析。实验结果 1.在5一FU作用下，胰腺癌细胞的一氧化氮合酶的活性明显增强，对照组（5 .26士2.18）U/m即rot，5一FU组（14.51土7.1）U/m即rot，P<0·05。 2.在其底物LArg存在的前提下，5一FU+L一Arg+LpS组NO的含量明显增加（595.8*29.20）林moFL，与其他各组相比差异显著（p<O·05）;细胞的凋亡率5一FU+L一Arg+LPS组为（14.54*3.12）%，与其他各组相比明显提高（p<0.05）。 3.这种效应可以被L一七g的拮抗剂L一NAME所抑制。结论1.在5一FU存在的情况下，胰腺癌细胞的NOS活性明显增加。2.5一FU和NO二者协同作用可以大大提高胰腺癌细胞的凋亡率。3 .NO可能是5一FU诱导胰腺癌细胞凋亡的效应分子。