研究背景新生儿缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是指各种围产期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤,临床出现一系列中枢神经系统异常的表现,是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一,将遗留诸多后遗症,如脑性瘫痪、智力低下、癫痫及发育迟缓等。随着新生儿重症监护室的建立和医疗技术水平的提高,许多中、重度缺氧缺血性脑损伤患儿得以生存,但存活儿永久性脑功能障碍发病率仍较高。HIBD是一种弥漫性损伤,病变主要在大脑海马、皮层、纹状体、基底节、丘脑等部位,发病机制较复杂,是由多种机制综合作用所致的一系列生化连锁反应或称缺氧缺血性瀑布的结果。目前临床上对于新生儿HIBD治疗多采用对症处理、营养支持及早期干预等综合治疗,尚缺乏特效、经济的方法来治疗新生儿HIBD,因此深入探究HIBD机制和修复机制,寻找有效的防治措施,对于提高新生儿HIBD存活率,减少存活儿远期神经系统后遗症,提高我国人口质量均有重要意义。新生儿处在大脑发育关键期,而且新生儿HIBD具有非进行性、无持续性的缺血缺氧因素存在等特点,生后7d SD大鼠脑与新生儿脑发育相似,而且造成一过性脑缺氧缺血条件也与HIBD相似,因此,国内外以生后7d新生SD大鼠为研究对象,参照Rice方法,建立新生鼠HIBD动物模型,该模型被广泛应用于研究HIBD相关课题。在上述基础上,利用动物模型,深入探讨HIBD后的损伤机制,了解缺氧缺血对新生大鼠远期神经功能和超微结构的影响,探索合理、全面的判断预后和评估疗效的方法,进一步寻求有效、经济的干预措施,并探讨干预措施的修复机制。HIBD是一种弥漫性损伤,由于HIBD致病因素的复杂性,加上婴幼儿脑发育的特殊性和可塑性,临床上要准确地评价HIBD的远期预后及干预疗效相当困难,许多患儿的预后与急性期损伤的严重程度并无一致的线性相关。而目前关于HIBD动物实验研究中,对于HIBD远期预后及干预措施疗效的评价多停留在行为学及上述两个脑区损伤后常规病理学改变的观察上,鲜有超微结构的研究。突触是神经元和效应细胞之间传递信息的功能部位,与行为学表现之间关系密切,也是脑发育可塑性的核心。因此,观察突触超微结构的改变不仅可以深入探究HIBD机理及修复机制,还可以了解其与行为学之间的相关性,从而有望对HIBD远期预后及干预疗效做出早期客观的评价。目前对于新生儿HIBD的治疗措施主要有高压氧、亚低温、神经营养药物及一般支持对症处理,高压氧治疗方法受医院条件设备限制、早期病情程度亦影响其应用,且治疗时间窗、疗程尚无统一定论等,而亚低温治疗方法不仅疗效不确定,而且应用范围较为局限,神经营养药物目前研究报道仅提示对疾病急性期有一定效果,且治疗费用高,影响其在临床上的应用。运动训练是指通过病人自身力量或治疗师的辅助操作或借助于器械所进行的主动或被动运动以改善局部或全身功能为目的的一种治疗方法。因其实施方便、费用低、治疗可长期坚持并可在家中实施,在临床上已应用于新生儿HIBD的治疗,取得一定疗效,但其具体机制尚未完全明确。一方面因为新生儿大脑正处在发育关键期,存在着较强可塑性,对损伤有一定自身修复能力,临床上很难判断患儿的进步是否与此干预治疗相关。另外,研究表明,适时适量的运动训练不仅能改善运动功能,而且可以提高人和动物的学习记忆能力。新生儿HIBD除运动功能障碍外,许多伴有智力低下、感觉统合失调等问题,早期运动训练是否也能改善患儿这些功能呢?是通过何种可能途径改善的呢?据研究报道,适宜的运动训练可以引起中枢神经系统内cAMP、Ca2+等第二信使适量增加,从而诱导c-fos基因表达,控制下游靶基因的转录,从而合成新的蛋白质。在正常情况下,c-fos蛋白参与细胞生长、分化、信息传递、学习和记忆等生理过程,它对于编码记忆,形成大多数的长时程增强(Long-term potentiation, LTP)有着十分重要的作用,而LTP是神经元可塑性的反映。因此,有利于大脑的记忆功能,这为运动对学习记忆的促进作用在分子水平上提供一个证据。已有研究指出突触素(p38)是突触重建的重要标志,因为p38参与神经元发育和分化过程。发育中神经元p38的表达优先于突触的构成,即在突触结构形成之前就已经有p38存在和表达,随着神经元发育成熟、突触成熟,p38的表达也相应增加。p38还直接参与了突触的形成及调节与突触相关的其它突触蛋白的表达。因此该蛋白被广泛用于标记突触终末。基于以上理论,本研究采用Rice方法建立新生大鼠HIBD模型,观察大鼠远期行为学、病理学及超微结构的改变,探索HIBD机制,重点观察超微结构的改变及其意义,指导HIBD远期预后及疗效评估。之后早期给予运动训练干预,观察其对新生大鼠HIBD远期运动、学习记忆能力及感觉功能的疗效,并利用免疫组织化学方法检测c-fos、突触素的表达,来初步探索其疗效机制。具体研究内容包括以下两个部分：第一部分构建新生大鼠HIBD动物模型,观察远期行为学及超微结构改变目的建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)模型,观察远期行为学及超微结构改变,提供HIBD远期功能评价方法及指导临床治疗。方法60只7日龄新生SD大鼠随机分为HIBD组和假手术组,每组30只。生后5周进行Morris水迷宫及感觉功能测试；取脑组织切片行尼氏染色计数神经元数目；取皮层、海马行透射电镜,观察突触结构、测量突触后致密区厚度及活性区长度,并与行为学结果进行相关分析。结果Morris水迷宫测试中,HIBD组大鼠寻找平台潜伏期时间明显长于假手术组(P<0.05);HIBD组大鼠穿越平台次数较假手术组少(P<0.05)。HIBD组感觉运动功能测试结果明显差于假手术组。尼氏染色提示HIBD组神经元数目明显减少(P<0.01)。电镜显示,HIBD组大鼠突触数量减少,突触后致密区厚度及活性区长度变薄变短。HIBD组大鼠海马突触后致密区厚度与Morris水迷宫寻找平台潜伏期时间呈负相关(r=-0.861,P=0.006),与三项感觉功能评估得分之和呈负相关性(r=-0.758,P=0.029)。结论缺氧缺血可致新生鼠远期神经元减少和超微结构损伤,造成远期行为学功能障碍,超微结构改变在一定程度上优于病理观察,有助于更好评估预后和评价疗效,基于未成熟脑突触的可塑性,在脑发育关键期指导临床治疗。第二部分早期运动训练对新生大鼠HlBD远期神经功能的影响目的探讨早期运动训练对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤远期病理、超微结构、神经功能的影响。方法90只7日龄SD大鼠随机分为运动组、对照组和假手术组。运动组和对照组建立HIBD模型,运动组于HIBD后1周开始每天给予抓握、旋转、行走、平衡等训练。4周后检测各组大鼠神经功能评分、空间学习记忆和皮层感觉功能、透射电镜观察突触和神经元超微结构,HE染色观察脑组织病理改变,尼氏染色计数神经元数目,并检测突触素、c-fos表达水平。结果运动组神经功能评分、空间学习记忆、皮层感觉功能均优于对照组,和假手术组间差异无统计学意义。透射电镜下对照组大鼠海马和皮层突触损伤严重,神经毡区突触减少,突触前膨大肿胀、轮廓不清晰,突触小泡溶解空泡形成,PSD变薄、薄厚不均,而运动组未见明显异常。HE染色提示对照组神经元数目明显减少,可见肿胀坏死细胞,运动组与假手术组比较未见明显异常,尼氏染色提示对照组神经元数目明显减少,与运动组及假手术组比较差异有统计学意义。运动组大鼠海马和皮层突触素、c-fos表达水平明显高于对照组(均P<0.05)。结论早期运动训练可减少缺氧缺血后海马和皮层神经元死亡,增强突触可塑性,从而改善HIBD后远期神经功能。早期运动训练使突触素和c-fos在海马和皮层强表达可能是其改善的机制之一。