煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞Keap1-Nrf2/ARE通路的影响

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流行病学及动物实验证实煤焦沥青(CTP)具有致癌性,它所引起的肺癌已经归于职业肿瘤。CTP成分复杂,致癌机制至今仍不清楚。为抵御外界环境的侵扰,哺乳动物在进化过程中形成了一套复杂而严密的信号机制,以及时打开或关闭内源性抗氧化系统,维持机体稳态,其中一个重要的抗氧化系统即Keap1-Nrf2/ARE信号通路。目前研究发现该通路是机体调节保护基因表达升高以应对氧化应激反应的主要通路,它主要通过调节NAD(P)H:苯醌氧化还原酶1(NQO1)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶以及金属硫蛋白等多种抗氧化蛋白和酶来发挥抗氧化作用。目的鉴于Keap1-Nrf2/ARE通路的重要作用,本课题拟采用煤焦沥青为受试物来探讨该通路在BEAS-2B细胞中的作用机制,为肺癌的早期预防提供可行的策略和靶标。方法1煤焦沥青受试物的制备及其成分分析中国铝业股份有限公司河南分公司(上街铝厂)中温CTP加热至400℃,粉尘采样器收集其挥发烟气,二甲基亚砜(DMSO)溶解终产物,母液浓度为2 mg/ml;气相色谱/质谱联用(GC-MS)技术检测CTP烟提取物成分。2细胞毒性实验BEAS-2B细胞活性试验确定染毒浓度。不同染毒浓度作用24h后,台盼兰计数活细胞。3基因与蛋白表达检测Real time PCR技术观察不同处理组作用BEAS-2B细胞3h、6h、12h、24 h后Nrf2、Keapl、NQO1基因表达情况;Western blot技术观察不同染毒剂量作用BEAS-2B细胞6h后Nrf2、Kea1、NQO1蛋白表达情况,并观察5μg/ml CTP作用BEAS-2B细胞3h、6h、12h、24h后Nrf2蛋白表达情况。4统计分析采用SPSS12.0软件进行t检验、ANOVA、Prohit回归、直线回归分析、LSD及SNK等方法分析,α=0.05为检验水准。结果1煤焦沥青GC-MS成分分析CTP烟提取物经GC-MS分析,主要成分为多环芳烃类化合物(PAHs), PAHs占91.0%以上。2细胞毒性实验CTP烟提取物对BEAS-2B细胞具有毒性作用。Probit回归计算得到细胞半数抑制浓度IC50为8.11μg/ml。3基因与蛋白表达情况不同染毒剂量作用BEAS-2B细胞后各个基因mRNA相对表达量差别无统计学意义,而作用不同时间点相对表达量差别有统计学意义。6μmol/L的全反式维甲酸(ATRA)作用于BEAS-2B细胞,Nrf2mRNA相对表达量要高于各浓度CTP烟提取物染毒组,而经6μmol/L ATRA预处理0.5h再给予5μg/ml CTP染毒BEAS-2B细胞后Nrf2 mRNA相对表达量却低于单独用5μg/ml CTP烟提取物染毒,NQO1表达趋势与Nrf2一致。随着染毒浓度的增加,Keap1蛋白无明显变化,NQO1蛋白表达量逐渐上升;5μg/ml染毒时Nrf2蛋白表达最高,此浓度时Nrf2蛋白表达量随时间延长逐渐升高,6h后达到最高,之后表达量又呈下降趋势。结论煤焦沥青烟提取物作用于BEAS-2B细胞后,代谢酶NQO1表达上调,推测Keap1-Nrf2/ARE通路可能通过上调细胞保护性基因NQO1的表达而对抗煤焦沥青毒性作用,降低细胞氧化损伤。
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