论文部分内容阅读
背景Sirtuins家族是赖NAD+依组蛋白去乙酰化酶家族的第Ⅲ类去乙酰化酶,在细胞活动的很多方面都有重要的作用。去乙酰化酶3(SIRT3)是主要的线粒体内的去乙酰化酶,去乙酰化酶能使许多氧化通路活化,从而在细胞的主要代谢中发挥作用。SIRT3能够参与线粒体蛋白的表达与激活,降低氧化应激作用产生的ROS水平,其缺失会导致代谢异常,并引起氧化应激反应和一系列与衰老相关的病理症状。这可能为临床上相关疾病的研究提供重要靶点。在实验中当老鼠血液干细胞灌输SIRT3,将再生形成新的血液细胞,呈现细胞功能性衰老退化的逆转现象。红鳍东方鲀是具有最小基因组大小的脊椎动物,但基因数目却与人相近,外显子/内含子、启动子等调控区域也是非常保守,也是常用的模式生物之一。因此,在本研究我们拟获得SIRT3的重组蛋白,为进一步在动物试验中研究代谢性相关疾病及抗衰老等功能研究提供可靠的基础材料。目的获得红鳍东方鲀SIRT3基因的序列,并与哺乳动物的SIRT3进行生物信息学分析。构建了SIRT3基因的原核表达载体并进行蛋白的表达及纯化,为进一步在活体上研究SIRT3抗衰老等功能奠定基础。方法1.采集红鳍东方鲀肝脏组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆了红鳍东方鲀SIRT3基因的ORF,并利用生物信息学方法对序列进行分析。2.构建原核表达载体PET-32/SIRT3,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,经IPTG诱导后进行融合蛋白表达,Western blot鉴定表达产物。结果1.红鳍东方鲀SIRT3基因的克隆、序列分析。获得红鳍东方鲀SIRT3基因ORF区的全长cDNA的序列,长度为1263bp,编码由420个aa,蛋白质分子量为:45.48 kD,等电点为:8.10。其氨基酸序列与大黄鱼、梭子鱼、半滑舌鳎、尼罗罗非鱼、非洲爪蟾、兔子、裸鼢鼠及绿头鸭的同源性分别为87%、86%、83%、77%、60%、59%、58%、57%。构建的系统发育树显示与大黄鱼和梭子鱼的进化关系最近,亲缘关系最为密切。2.成功获得pET-32a(+)/SIRT3重组质粒设计一对包红鳍东方鲀SIRT3基因的ORF区并带有双酶切位点的引物,PCR后克隆到pET-32a(+)原核表达表达载体,进行双酶切与测序双重鉴定,证实成功获得了pET-32a(+)/SIRT3重组质粒。3.在大肠杆菌中的成功表达pET-32a(+)/SIRT3重组质粒将获得的重组质粒pET-32a(+)/SIRT3转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经1.0 mM IPTG,37℃5 h诱导表达,利用SDS-PAGE电泳检测发现融合蛋白分子量为66 kD左右,与预测的分子量一致。4.纯化及鉴定重组蛋白pET-32a(+)/SIRT3超声波离心后进行上清的收集,然后上用纯化柱(6×His Ni-NTA)进行纯化后收集蛋白。采用Western blot分析发现在66 kD出现目的条带,证明已纯化得到融合蛋白为目的蛋白SIRT3。结论本研究获得了红鳍东方鲀SIRT3基因的完整的ORF序列,并成功构建pET32a/SIRT3重组质粒,利用IPTG对重组质粒pET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并利用镍柱纯化了融合表达蛋白,为抗体的制备及深入的研究SIRT3蛋白的抗衰老功能提供了基础的材料。