作为单细胞真核生物,家蚕微孢子虫是一种专性细胞内寄生的病原微生物。它可以感染重要的经济昆虫家蚕,并导致微粒子病的发生。微孢子虫的孢壁是最先、最直接与宿主结合的部位,它在微孢子虫的侵染和免疫逃避过程中发挥着重要的功能作用。因此,微孢子虫的孢壁构成和形成机理一直受到学术界的关注。微孢子虫的孢壁包括高电子密度的富含蛋白质的外壁、低电子密度的由几丁质和蛋白质构成的内壁以及质膜三层结构。近年来,研究人员对微孢子虫的孢壁开展了诸多研究,已有部分孢壁蛋白被成功鉴定。但是,由于微孢子虫的孢壁结构独特,构成成分也比较复杂,迄今有关在微孢子虫孢壁蛋白研究方面的积累,对于阐明微孢子虫孢壁的形成机制而言还显得比较有限。为了推动微孢子虫孢壁形成机制的研究,进一步对微孢子虫孢壁中的其它蛋白成分,特别是对具有特殊序列特征和结构域的孢壁蛋白展开研究就显得尤为必要。有鉴于此,本文通过基因组扫描获得一批可能与家蚕微孢子虫侵染和免疫逃避相关的潜在孢壁蛋白,并对其中两个候选蛋白开展了较为深入的研究,其中一种为具有串联重复序列特征的蛋白NBO₂9g0021 （NbHSWP16）,另一种为具有otubain结构域和去泛素化蛋白酶活性的蛋白NBO₅3g0008 （NbOTU1）。研究结果证明这两个蛋白的确是有别于先前报道的家蚕微孢子虫孢壁蛋白的新成员。主要研究结果如下：一、具有串联重复序列特征的蛋白NbHSWP16的研究1家蚕微孢子虫串联重复蛋白的比较基因组学分析1.1家蚕微孢子虫串联重复蛋白的筛选及特征分析据研究报道,在专性细胞内寄生虫中,大部分串联重复蛋白都位于寄生虫的表面。因此,利用两种针对基因组蛋白质中串联重复序列的筛选算法,即XSTREAM和T-reks,对家蚕微孢子虫串联重复蛋白进行筛选。通过对这两种算法获得的检索结果进行比较,最终获得396个候选蛋白,其占家蚕微孢子虫基因组编码总蛋白的比例为8.86%。这396个候选蛋白中串联重复序列所在的位置和它们的氨基酸组成的分析结果表明：在家蚕微孢子虫中,串联重复序列在其所在蛋白中的位置分布是随机的,不具有位置偏好性；在氨基酸组成方面,它们倾向于利用极性的氨基酸来组建其序列,而对疏水性的氨基酸则相对比较排斥。编码串联重复序列的核酸序列GC含量与家蚕微孢子虫基因组的GC含量的比较分析表明：串联重复序列所对应核酸序列的GC含量要高于家蚕微孢子虫基因组的GC含量。对获得的396个候选蛋白基因的功能进行GO分类分析,发现这些蛋白主要涉及的功能有细胞构成、分子结合、细胞催化过程、细胞过程和代谢过程等,另外,还发现一些蛋白可能与蛋白定位和信号应激有关。1.2家蚕微孢子虫串联重复蛋白的比较基因组学分析从NCBI数据库下载其他9种微孢子虫的基因组编码蛋白信息,其中包括4种感染昆虫的微孢子虫Nosema ceranae.Nosema apis、Vavraia culicis 和 Antonospora locustae以及1种感染线虫的微孢子虫Nematocida parisii 和 4中感染哺乳动物的微孢子虫Encephalitozoon cuniculi、 Encephalitozoon hellem、Encephalitozoon intestinalis和Enterotycozoon bieneusi。并将这9种微孢子虫中串联重复蛋白的序列特征与家蚕微孢子虫进行比较基因组学分析,结果表明：感染昆虫的微孢子虫以及感染线虫的微孢子虫中串联重复蛋白的数目要大于感染哺乳动物的微孢子虫中的数目。其中,串联重复蛋白数目最少的为感染哺乳动物的比氏肠道微孢子虫E.bieneusi;串联重复蛋白数目最多的为感染蜜蜂的微孢子虫N.apis。这10种物种中串联重复序列位置分布的比较分析表明：在微孢子虫N.ceranae、N.apis、V. culicis和A.locustae以及N.parisii中,除了A. locustae倾向于分布在中间位置外,其他4种微孢子虫中串联重复序列的位置分布情况基本与家蚕微孢子虫N.bombycis中的分布情况相一致,即他们都倾向于随机分布。然而,在感染哺乳动物的4种微孢子虫E.cuniculi、E.hellem、E.intestinalis和E.bieneusi中,它们的重复序列位置分布情况则与家蚕微孢子虫存在一定的差异。与家蚕微孢子虫相比,这4种微孢子虫中重复序列的位置倾向于分布在蛋白的中间位置或者C末端位置,而其在N末端位置所占的比例则相对偏小。串联重复序列氨基酸组成情况的比较分析表明：除A.locustae外,其余8种微孢子虫串联重复序列的氨基酸组成情况基本与家蚕微孢子虫中的组成情况相一致,即他们都倾向于利用亲水性的氨基酸来组建其串联重复序列,而对疏水性的氨基酸则相对比较排斥。GC含量的比较分析表明：在所选择的其他9种微孢子虫中,除比氏肠道微孢子虫E.bieneusi,其他8种微孢子虫串联重复序列对应核酸序列的GC含量均高于其基因组的GC含量。这一结果说明,大多数微孢子虫串联重复蛋白具有选择高GC含量的密码子对其序列进行编码的偏好性。1.3家蚕微孢子虫潜在孢壁蛋白的预测及部分蛋白编码基因的转录谱分析为了获得家蚕微孢子虫的潜在孢壁蛋白,以蛋白序列中是否含有信号肽、跨膜结构域或者GPI锚定位点,同时重复序列的长度大于5并且重复序列的一致性大于80%为条件,对家蚕微孢子虫中获得的396个蛋白进行筛选分析。结果共获得86个家蚕微孢子虫的潜在孢壁蛋白,其中含有信号肽的蛋白有37个,含有跨膜结构域的蛋白有45个,同时含有信号肽和跨膜结构域的蛋白有4个。同时,以相同的方法对其他9种微孢子虫中的潜在孢壁蛋白也进行预测,结果发现感染哺乳动物微孢子虫的潜在孢壁蛋白的个数要少于感染昆虫和线虫的微孢子虫中的蛋白个数。为了对微孢子虫中串联重复蛋白的功能研究寻找线索,对家蚕微孢子虫中的4个串联重复序列蛋白基因进行RT-PCR分析。结果表明：在添食家蚕微孢子虫3天后,编码NBO₂4g0018和NBO₂9g0021 （NbHS WP16）蛋白的基因开始表达；在添食家蚕微孢子虫4天后,编码NBO₄90g0001蛋白的基因开始表达；在添食家蚕微孢子虫5天后,编码NBO₃78g0015蛋白的基因开始表达。2家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16的鉴定及功能分析2.1家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbHSWP16的序列特征分析采用生物信息学的方法对NbHSWP16进行序列特征分析,结果发现编码该蛋白的基因由1152个核苷酸组成,编码383个氨基酸oNbHSWP16的预测分子量为44.0 kDa,等电点为8.95。磷酸化位点和糖基化位点预测发现,该蛋白序列中含有30多个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点。同时,还发现NbHSWP16含有29个半胱氨酸残基（7.6%）,推测其可能会通过形成二硫键的方式来稳定蛋白质的结构。该蛋白在N末端具有一个由25个氨基酸组成的信号肽序列,但没有GPI锚定位点和跨膜结构域。另外,在NbHSWP16序列中,靠近C末端区域含有3个潜在肝素结合基序（HBM）,靠近N末端区域含有3个由13个氨基酸组成的富含脯氨酸的串联重复序列,并且序列比对结果发现,这个串联重复序列不与任何已知的蛋白序列存在同源性。对NbHSWP16进行二级结构预测,结果发现这个蛋白中含有6个α螺旋和12个β折叠。同源序列比对,共线性分析和序列进化分析结果表明,HSWP16在微孢子虫中是一个相对比较保守的蛋白,推测其对微孢子虫来说,可能是一个必不可少的蛋白。2.2家蚕微孢子虫孢壁蛋白1NbHSWP16的鉴定基于上述NbHSWP16的序列分析结果,设计家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbHSWP16去掉信号肽的引物,对编码该蛋白的基因进行T克隆。测序验证正确后,将其克隆到原核表达载体pET30a中,在37℃C,04 mM IPTG条件下,对其进行诱导表达。当检测到蛋白表达后,对其进行纯化,并制备其鼠多克隆抗体。免疫印迹结果表明NbHSWP16的鼠多克隆抗体可以与家蚕微孢子虫总蛋白发生免疫反应。NbHSWP16的鼠多克隆抗体可以在孢子总蛋白中杂交到一条特异的与假定孢壁蛋白NbHSWP16预测理论分子量大小一致的杂交条带,但是含量却相对较低,这说明NbHSWP16在成熟家蚕微孢子虫中有表达,暗示该蛋白可能在家蚕微孢子虫中发挥功能。利用间接免疫荧光技术和免疫胶体金技术对NbHSWP16蛋白在家蚕微孢子虫中的定位情况进行分析。间接免疫荧光实验结果表明NbHSWP16可以被定位在成熟家蚕微孢子虫的孢壁上,并且在获得的成熟孢子的孢壳上也可以获得较强的定位信号。接着,利用免疫胶体金技术对成熟家蚕微孢子虫中NbHSWP16的精细定位情况进行分析。结果表明NbHSWP16在成熟家蚕微孢子虫中主要定位于孢子外壁,这说明NbHSWP16是一个孢子外壁蛋白,因此将其更名为NbSWP16。另外,为了调查NbSWP16在家蚕微孢子虫发育过程中的表达情况,以分离纯化的不同发育时期的家蚕微孢子虫（母孢子,早期孢子母细胞和晚期孢子母细胞）和感染家蚕微孢子虫的家蚕BmE细胞为材料,利用共聚焦荧光显微镜对NbSWP16的表达时期进行研究。结果表明在孢子孢壁开始形成的早期阶段,该蛋白已经开始表达,并且随着孢子的发育,该蛋白的表达量有逐渐增加的趋势。这一结果与第三章中Nbswpl6基因在RNA水平上的转录分析结果相一致,推测该蛋白可能参与家蚕微孢子虫孢壁的组装过程。2.3家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16的功能分析2.3.1家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16在细胞黏附过程中的作用分析由NbSWP16蛋白的序列分析可知,该蛋白含有三个潜在的肝素结合基序,并且用间接免疫荧光和免疫电镜结果证实NbSWP16蛋白是一个家蚕微孢子虫孢外壁蛋白。因此,利用抗体封闭实验在细胞水平上对NbSWP16蛋白在孢子黏附宿主细胞过程中的功能进行研究。结果表明NbSWP16蛋白的抗体可以抑制家蚕微孢子虫对宿主细胞的黏附,抑制率大约为20%左右。这一结果说明NbSWP16蛋白可能参与孢子对宿主细胞的黏附过程。但是当用NbSWP16蛋白和另一个孢壁蛋白NbSWP5的抗体同时进行抗体封闭实验时,发现这两个抗体同时使用时的抑制效果与NbSWP16蛋白的抗体单独使用时的抑制效果并不存在明显差异,该结果说明这两个抗体在抑制家蚕微孢子虫对宿主细胞的黏附过程中可能不存在叠加效应。2.3.2家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16中重复序列与其蛋白功能的相关性分析利用酵母定位系统和应激性实验对NbSWP16蛋白中存在的重复序列的功能进行研究。成功构建NbSWP16蛋白的酵母载体pUG35-Nbswpl6以及缺失NbSWP16蛋白重复序列的突变体pUG35-Nbswp16△1和pUG35-Nbswpl6A2,并且将这些载体转化到酵母细胞中获得相应的重组酵母。PCR和免疫印迹结果表明Nbswpl6及其突变体基因均成功转化到酵母中并且获得表达。酵母定位结果表明缺失NbSWP16蛋白重复序列的突变体酵母中的定位情况与pUG35-Nbswp16菌株中的定位情况相比不存在差异,这表明NbSWP16蛋白中的重复序列可能与其在细胞内的定位情况无关。酵母应激性实验结果表明,和对照相比,表达NbSWP16蛋白及其突变体的酵母在面对由变性剂0.2% SDS、5%β-巯基乙醇以及0.1M DTT创造的应激条件时,与对照相比,这三个菌株对这些应激条件均不敏感。当在面临由0.05M NaOH制造的碱性条件和55℃的热激条件时,表达NbSWP16蛋白及其突变体的酵母均表现一定的抗逆能力。与表达NbSWP16蛋白的酵母相比,表达缺失NbSWP16重复序列的酵母抵御55℃的热激条件时的抗逆能力没有发生明显变化,但是它们对由0.05M NaOH创造的碱性条件的抗逆能力则有所降低。由上述结果可知,NbSWP16蛋白具有一定的抵御外界碱性条件和热激条件的能力,并且NbSWP16蛋白序列中的重复序列可能与其具有抵御碱性条件的能力有关。2.3.3家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16的互作蛋白分析利用酵母双杂交技术结合本实验室构建的孢壁蛋白文库对家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16的互作蛋白进行分析。结果表明：NbSWP16蛋白可能与家蚕微孢子虫的孢壁蛋白NbSWP1、NbSWP3、NbSWP5 以及 NbHSWP6之间存在相互作用。这一结果为家蚕微孢子虫孢壁蛋白间互作关系的研究提供了新的线索。二、具有otubain结构域的孢壁蛋白NbOTUl的研究1家蚕微孢子虫侵染相关蛋白酶的检索分析据文献报道,病原微生物的蛋白酶在其侵染和免疫逃避过程中发挥着重要作用,蛋白定位分析结果表明部分蛋白酶也被定位于病原微生物的表面。利用全基因组检索的办法,对家蚕微孢子虫中的侵染相关蛋白酶进行检索,结果发现家蚕微孢子虫中存在大量的金属蛋白酶；相对少量的丝氨酸蛋白酶以及半胱氨酸蛋白酶。然而没有检索到天冬氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶的存在。其中,金属蛋白酶主要分为M1、M16、M17、M24和M485个家族,共有22个；丝氨酸蛋白酶为丝氨酸S8家族蛋白酶,共有3个；半胱氨酸蛋白酶为注释为具有otubain结构域的去泛素化蛋白酶,共有3个。有报道称,在病原微生物中,去泛素化蛋白酶可能与其逃避宿主的先天性免疫逃避过程相关,因此,为了阐述家蚕微孢子虫的去泛素化蛋白酶是否与该过程有关,以具有otubain结构域的NbOTU1为对象进行后续研究。2 家蚕微孢子虫NbOTU1的序列特征分析同源序列比对和进化分析发现,该蛋白在微孢子虫中是比较保守的。另外,从同源序列比对和蛋白三维结构模拟结果中,还可以发现该类蛋白都含有otubains蛋白酶家族所特有的催化三联体结构位点,即天冬氨酸残基（D46）、半胱氨酸残基（C45）和组氨酸残基（H209）。值得注意的是,感染哺乳动物微孢子虫中的otubains蛋白的序列保守性要相对高于感染昆虫微孢子虫的otubains,这说明在不同的微孢子虫属中该类蛋白还存在一定的差异性。3 家蚕微孢子虫NbOTU1的鉴定及功能分析对bOTU1进行克隆表达并获得其可溶蛋白。接着对其进行抗体制备,并利用免疫印迹、间接免疫荧光、免疫电镜和体外酶活检测的方法对其进行鉴定和功能分析。免疫印迹结果表明,NbOTUl在家蚕微孢子虫中有表达,并且在家蚕微孢子虫发芽时,可以随着极管的弹出被分泌到细胞外。NbOTU1蛋白的体外酶活实验结果表明纯化的重组NbOTU1蛋白可以对K48的泛素四聚体进行降解,这说明该蛋白具有去泛素化能力。间接免疫荧光和免疫电镜结果表明,该蛋白在家蚕微孢子虫中主要分布于靠近孢壁的内壁及质膜区域。由上述结果可知,NbOTU1蛋白是家蚕微孢子虫孢壁蛋白中的一个新成员,并且其具有去泛素化酶的活性。据目前已有的文献报道可知,bOTU1是微孢子虫中第一个被鉴定的具有去泛素化功能的蛋白酶。综上所述,本文完成家蚕微孢子虫串联重复蛋白的比较基因组学分析,并对家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16进行鉴定和功能分析；随后,也将家蚕微孢子虫的去泛素化蛋白酶NbOTU1成功鉴定为另一个新的孢壁蛋白。本研究不仅丰富了家蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成,而且也为阐明微孢子虫孢壁的形成机制研究提供了新的线索和支撑。