Klotho基因缺失小鼠通过PI3K-Akt-FoxO途径加重他克莫司诱导的肾损伤

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目的:检测在慢性他克莫司(Tacrolimus;Tac)肾病的实验模型中Klotho表达是否影响Tac诱导的肾损伤。方法:步骤一:首先选取野生型(WT)健康小鼠,给予低盐饲料1周后,将体重匹配的动物随机分配为4组,每组包含8只小鼠,具体分组如下:(1)VH组:每天皮下注射(s.c.)5ml/kg橄榄油共4周;(2)Tac 0.25组:每天皮下注射Tac(0.25mg/kg/d)共 4 周;(3)Tac 0.5 组:每天皮下注射 Tac(0.5mg/kg/d)共 4 周;(4)Tac 1.0组:每天皮下注射Tac(1.0mg/kg/d)共4周。我们通过对WT小鼠给予不同剂量的Tac(0.25,0.5和1mg/kg/d)来评估Tac剂量与Klotho表达之间的关联。步骤二:该实验分为2组,8周龄的雄性Klotho heterozygous(HT)小鼠购自日本CLEA,随机选取WT小鼠与HT小鼠各8只,具体分组如下:(1)WT组:每天皮下注射Tac(1.Omg/kg/d)共4周;(2)HT组:每天皮下注射Tac(1.Omg/kg/d)共4周。我们比较了 WT小鼠和Klotho HT小鼠在慢性Tac肾病的实验模型中的Klotho水平,肾功能,纤维化和细胞凋亡相关指标表达量。步骤三,我们检查了氧化应激和Phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)-Akt-Forkhead box protein 0(Fox0)信号通路是否参与Klotho对Tac诱导的肾损伤的保护,其中主要检测了 8-Hydroxy-2’-deoxyguanosine(8-OHdG),4-HHE,PI3K,Akt,Fox(01,Fox03a,Manganese speroxide dismutase(MnSOD)和 Bim 等参数的表达。结果:(1)在实验步骤一不同剂量的Tac处理的WT小鼠中,与对照组小鼠相比,血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)浓度以剂量依赖性方式增加,Collagen Ⅰ和尿8-OHdG排泄量也以剂量依赖性方式增加,肾组织和尿液中的Klotho水平以剂量依赖性方式降低。(2)在实验步骤二中,与WT小鼠相比,敲除Klotho基因的HT小鼠在肾皮质和尿液中表现出更低的Klotho水平,并且Scr水平升高,纤维化和凋亡程度也更高。(3)氧化应激指标的测定结果,与WT小鼠相比,8-OHdG在Tac处理的HT小鼠的尿中的排泄量和血清中的表达均显著增高;与WT小鼠相比,4-HHE在Tac处理的HT小鼠的组织切片中表达的水平也更高。(4)Tac对WT小鼠的干预增加了氧化应激反应,增加了 PI3K,Akt和Fox03a的磷酸化,但降低了 Fox01的去磷酸化,这些效应在HT小鼠中表现更为严重。(5)对Fox0的靶基因MnSOD和Bim进行了免疫印迹分析。与对照组小鼠相比,在Tac处理的WT小鼠中检测到MnSOD的较低表达和Bim的较高表达。这些效应在Tac处理的HT小鼠中表现更加明显。结论:根据上述实验,我们得到以下结论:(1)慢性Tac治疗以剂量依赖性方式降低Klotho表达。(2)降低Klotho的表达加重Tac诱导的肾病程度及其氧化应激反应。(3)针对Tac治疗的应答涉及Klotho缺陷小鼠中的PI3K-Akt-Fox0途径。
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