论文部分内容阅读
圭亚那柱花草(Stylosanthes guianensis)为豆科(Leguminosae)柱花草属(Stylosanthes Sw)多年生植物。它是世界热带地区利用广泛的豆科牧草,也是我国南方豆科牧草的主栽品种。其可供放牧利用、刈割青饲、果园间作或绿肥生产。随着分子生物学的快速发展,各种不依赖于环境影响的分子标记的开发也在迅速发展,同时分子标记也为育种提供了有效手段。目前随着分子标记的发展,柱花草进行了种质资源鉴定分类、构建遗传图谱和植物分类等方面的相关研究,但在关于柱花草杂交后代育性分离群体的ISSR标记、SRAP标记和SCAR标记研究还不够完善。本研究以1979(雄性不育)柱花草为母本,以热研5号柱花草、热研2号柱花草、TPRC273柱花草和TPRC90075柱花草为轮回父本,依次命名为组合A、B、C、D,获得了 BC1F1可育和不育分离群体。在此基础上,本研究以BC1F1代分离群体为研究对象,利用ISSR和SRAP分子标记技术结合BSA法,筛选与柱花草花粉不育基因连锁的ISSR及SRAP特异分子标记,并将之转化为稳定的SCAR标记,为后续柱花草杂交育种工作奠定了良好的基础。本研究的主要结果如下:(1)以改良的CTAB法提取BC1F1代可育和不育分离群体基因组DNA,分别构建了这四个BC1F1代分离群体的花粉不育和可育基因池。(2)优化了 ISSR分子标记的最佳PCR反应体系。其体系总体积为15μL,包括模板 DNA 75 ng,ISSR 引物 0.66 μmol/L,2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE(含染料)7.5 μL。(3)从100条ISSR引物中共筛选到33条引物在四个组合的BC1F1代群体的花粉不育基因池中表现出多态性。其中组合A筛选出9条引物,扩增出14条特异条带,并在BCiF1代分离群体中成功验证5个特异性标记,其中UBC807-950、UBC834-500和UBC835-600发生重组,重组率分别为3.33%、3.33%和13.33%。组合B筛选出11条引物,扩增出15条特异条带,并在BC1F1代分离群体中成功验证12个特异性标记,其中 UBC808-650、UBC816-600、UBC817-300、UBC817-500、UBC836-250、UBC840-200 和 UBC881-220 发生重组,重组率分别为 23.33%、20.00%、6.67%,13.33%、10.00%、3.33%和3.33%。组合C筛选出8条引物,扩增出9条特异条带,并在BC1F1代分离群体中成功验证8个特异性标记,其中UBC811-650发生重组,重组率16.67%。组合D筛选出5条引物,扩增出7条特异条带,并在BC1F1代分离群体中成功验证4个特异性标记,其中UBC841-700和UBC853-550标记发生重组,重组率分别为10.00%和 6.67%。(4)从400对SRAP引物中共筛选到38对引物在四个组合的BC1F1代群体的花粉不育基因池中表现出多态性。其中组合A中筛选出11对引物,扩增出12条特异条带,并在BC1F1代分离群体中成功验证7个特异性标记,其中M1E18-550、M14E20-150和M14E20-500发生重组,重组率分别为3.33%、10.00%和6.67%。组合B筛选出7对引物,扩增出7条特异条带,并在BC1F1代分离群体中成功验证3个特异性标记,其中M11E8-200发生重组,重组率6.67%。组合C筛选出7对引物,扩增出8条特异条带,并在BC1F1代分离群体中成功验证4个特异性标记,其中M10E19-400和M13E12-80发生重组,重组率为6.67%和10.00%。组合D筛选出13对引物,扩增出13条特异条带,并在BC1F1代分离群体中成功验证8个特异性标记,其中M2E10-350、M5E10-300、M6E2-550和M6E7-450标记发生重组,重组率分别为 3.33%、3.33%、6.67%和 6.67%。(5)将筛选获得的ISSR和SRAP分子标记建立与不育基因遗传连锁关系图。组合A中12个标记与柱花草花粉不育基因连锁,5个ISSR标记UBC807-950(1.3cM)、UBC834-500(1.4cM)、UBC835-400(OcM)、UBC835-600(8.3cM)和 UBC835-700(2.OcM);7个SRAP标记M1E18-550(1.4cM)、M2E18-250(0cM)、M4E1-180(0cM)、M4E14-200(OcM)、M9E16-600(0cM)、M14E20-150(6.4cM)和M14E20-500(4.2cM)。组合B 中 15个标记与柱花草花粉不育基因连锁,其中12个ISSR标记UBC808-350(0cM)、UBC816-400(0cM)、UBC824-150(0cM)、UBC836-400(OcM)、UBC843-200(0cM)、UBC808-650(14.8cM)、UBC816-600(14.3cM)、UBC817-300(3.6cM)、UBC817-500(9.0cM)、UBC836-250(6.3cM)、UBC840-200(1.7cM)和UBC881-220(1.7cM);3个SRAP标记M1E18-300(0cM)、M11E8-200(3.2cM)和M14E13-650(0cM)。组合C中 11 个标记与柱花草花粉不育基因连锁,其中8个ISSR标记UBC807-400(OcM)、UBC811-200(0cM)、UBC820-350(0cM)、UBC824-300(0cM)、UBC834-200(OcM)、UBC846-300(0cM)、UBC853-450(0cM)和 UBC811-650(11.2cM);3 个 SRAP 标记 M10E19-400(3.5cM)、M13E12-600(0cM)和M17E10-500(0cM)。组合D中12个标记与柱花草花粉不育基因连锁,其中4个ISSR标记UBC841-300(0cM)、UBC853-400(0cM)、UBC841-700(6.8cM)和 UBC853-550(4.1cM);8 个 SRAP 标记 M1E2-300(0cM)、M4E1-150(0cM)、M5E9-300(0cM)、M15E16-350(0cM)、M2E10-350(1.7cM)、M5E10-300(1.4cM)、M6E2-550(3.5cM)和 M6E7-450(3.OcM)。(6)将筛选出与不育基因连锁的标记回收测序,共设计了 20个ISSR-SCAR标记的特异性引物,其中组合A、B、C、D中分别设计了 3、8、7、2个SCAR标记引物。在SRAP-SCAR标记中,设计了 20个SRAP-SCAR标记的特异性引物,其中组合A、B、C、D中分别设计了 6、3、3、8个SCAR标记引物,上述标记均通过了其对应的BC1F1代分离群体的验证,在BC1F1代的不育群体中具有多态性,已经成功转化与柱花草不育基因连锁的SCAR分子标记。