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研究背景前列腺癌(Prostate cancer,PCa)近年来已成为全球男性发病率第二高的肿瘤。前列腺癌的早期诊断和晚期治疗一直以来是研究的热点和难点。而作为肿瘤的标志性特征之一,肿瘤的代谢“重编程”也越来越多的为人们所重视。在肿瘤细胞中,为了给细胞以最有效的方式提供能量,同时为各项肿瘤细胞生命活动提供必须的小分子物质,肿瘤的代谢形式发生了相应转变。其中,糖脂代谢的改变是不可忽视的,在肿瘤的发生发展中均起到了重要作用。对于前列腺癌而言,一方面其与非肿瘤前列腺组织的糖脂代谢形式差异巨大,另一方面在不同的发展阶段,其糖脂代谢的方式也有着显著的异质性。探索这种差异和转变,对于早期诊断和晚期治疗前列腺癌都有着至关重要的意义。研究目的研究前列腺癌糖脂代谢的变化,探索揭示前列腺癌糖酵解的新形式-“糖酵解潜能”,从而为早期诊断和辅助治疗提供可能的新靶点;研究进展期前列腺癌中,脂链延长所发挥的作用,以寻求进展期前列腺癌治疗的新思路。研究方法采用代谢物质谱分析的方法,分析不同组织以及细胞样本之间的代谢物含量的差异。采用靶向代谢示踪法,研究糖酵解和糖三羧酸循环中间代谢物的起始来源。Seahorse XF系统用于监测能量产量及产生的具体途径。为检测细胞ATP产生水平,我们采用了ATP比色法进行了观察。RNA-Seq和组织芯片(TMA)数据分别用于在RNA水平和蛋白水平对基因的表达进行分析。生物信息学分析方面,我们结合TCGA等公共数据库,使用了基因组变异分析(GSVA)、基因集富集(GSE)分析作为总结归纳相关通路的方法。分子生物学研究方法,如Western blotting法、QPCR法、免疫荧光或免疫组化等方法用于观察相应分子的变化水平。采用CHIP方法研究基因之间的相互作用。在观察细胞增殖、凋亡及线粒体膜电位的实验中,我们采用了相应的试剂盒来进行研究。采用划痕实验、transwell实验观察肿瘤细胞的迁移能力。细胞生长方面,我们使用了细胞计数和染色等方法。为了研究不同代谢物对细胞生长的影响,我们根据不同实验需求调整培养基成分,采用条件培养基进行细胞培养,且外部给与相应的脂肪酸进行了条件培养基的补救实验进行观察。此外,为研究基因上调或下调对细胞表型的变化,我们应用了敲减质粒、过表达质粒以及慢病毒包装和CRISPR-CAS9等基因调控技术。在体实验研究中,我们使用了裸鼠及Nod-Scid小鼠,此后小鼠肿瘤成像以及18F-FDG-PET/CT用于观察肿瘤生长情况,放疗及腹腔注射给药用于肿瘤的治疗研究。研究结果通过对RNA-Seq数据库的研究我们发现,糖酵解水平在前列腺癌中显著下调,线粒体相关基因含量显著上升。前列腺癌和癌旁组织的代谢组学数据显示葡萄糖水平降低,丙酮酸、苹果酸,琥珀酸水平上升。此外,我们发现线粒体丙酮酸转运体(mitochondria pyruvate carrier2,MPC2)变化最为显著(P<0.05,上升2.47倍)。组织芯片(Tissue micro-assay,TMA)结果提示MPC1随着Gleason评分的上升,显著性下调,而MPC2无显著性差异,且MPC1与包膜侵犯、切缘侵袭等关系密切,MPC1/2与p-AKT,ERG等肿瘤重要的耐药及调控基因关系密切。细胞实验发现,高剂量UK5099(100μM)对所有细胞均起到了抑制生长和迁移的作用,而低剂量UK5099(10μM)可促进肿瘤细胞增殖、迁移和24小时内的ATP产生,而对良性前列腺细胞作用与之相反。代谢物质谱分析,低浓度UK5099使得C4-2B细胞系葡萄糖摄取量显著上升(2.73±0.10 vs.3.76±0.06,P<0.05),而BPH-1未观察到类似现象(2.62±0.05 vs.2.82±0.06)。乳酸含量中,低浓度UK5099使得C4-2B细胞系中乳酸产生显著性上升(14.15±0.71 vs.16.54±0.43,P<0.05)。尽管在代谢物含量的分析中,我们发现MPC小剂量或大剂量阻断后,所有细胞系的三羧酸循环代谢物均发生了显著性降低,而靶向代谢物示踪中,我们发现在C4-2B细胞系的柠檬酸和α-KG中碳原子来自于葡萄糖的百分比却上升而BPH-1细胞系中无此现象,提示前列腺癌细胞可能“糖酵解潜能”较大。免疫荧光结果显示UK5099高剂量可促进线粒体裂解,而VDAC1的蛋白水平在前列腺癌细胞和非肿瘤前列腺细胞中的变化差别最为明显。随后动物实验提示,使用UK5099可增加前列腺癌18F-FDG-PET/CT和放射治疗的敏感性。脂代谢实验中,经过雄激素剥夺治疗(ADT)或恩杂鲁胺处理之后的细胞,长链多元非饱和脂肪酸(PUFA)升高显著,且RNA-Seq数据也显示在神经内分泌前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC)细胞系中ELOVL5升高明显。敲除或敲低ELOVL5表达后,细胞生长未见显著性变化,但原本恩杂鲁胺耐药细胞重新对恩杂鲁胺敏感,而过表达ELOVL5时,原本对恩杂鲁胺敏感的细胞,恩杂鲁胺处理后细胞增殖降低比率下降。WB结果提示予以ELOVL5敲除或PUFA处理后,细胞的AKT-m TOR通路可能介导了其生物学作用。研究结论综合以上结果,我们发现MPC抑制剂对于非肿瘤前列腺细胞和前列腺肿瘤细胞作用不同,由此提出了MPC抑制诱发的“糖酵解潜能”假说。且将此差异应用于了在体实验,提高了18F-FDG-PET/CT和放疗的敏感性。通过线粒体形态、公共数据库分析和分子方面的观察,我们发现了VDAC1可能在糖酵解潜力中起重要作用。总体而言,糖酵解潜力是前列腺癌能量代谢的新模型,其关键酶MPC可能是早期诊断和治疗的关键靶标。而这一模型的提出也进一步补充了现有的肿瘤代谢重编程体系。脂代谢方面实验显示,PUFA在神经内分泌前列腺癌细胞系中和ADT处理之后显著增高,且其相关基因ELOVL5表达量上升。因此,脂肪酸碳链延长在神经内分泌前列腺癌的发展和耐药中起到了重要的作用。其中关键酶ELOVL5及其产物之一花生四烯酸在整个疾病进展中意义重大,更重要的是在肿瘤的耐恩杂鲁胺中起到了关键性作用。而这也为进一步的临床治疗恩杂鲁胺耐药的前列腺癌提供了新的可能靶点。