口蹄疫(foot and mouth disease, F MD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性的传染病。FMDV是单链正义RNA病毒,属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。病毒基因组的长度约为8500 nt。FMDV可以感染70多种偶蹄目动物,包括猪、牛、羊等家畜。FMD是国际兽疫局规定的A类传染病,大规模爆发会给养猪业造成巨大的经济损失。目前,注射疫苗是控制口蹄疫疫情的重要手段,但病毒具有高度的变异性,导致疫苗有效性大为降低。最近的研究已经证实在哺乳动物中RNA干扰(RNAi)可以作为一种抗病毒机制。因此,通过RNAi和转基因技术培育出表达针对口蹄疫病毒的shRNA的抗病转基因猪新品种,可能成为防控口蹄疫的有效途径,从而保障养猪业的健康发展。本研究针对口蹄疫病毒基因组保守区3D聚合酶基因和2B非结构蛋白基因设计并构建了表达shRNA抗病毒干扰载体。转基因细胞具有稳定的shRNA表达,并且和对照细胞相比,表达shRNA的转基因细胞具有高效的抗FMDV的能力。在100和1000TCID50剂量的病毒攻毒后,表达shRNA的转基因细胞中的病毒产量显著减少(P≤ 0.05),细胞病变效应CPE也明显减少。然后通过体细胞核移植技术得到23头shRNA转基因克隆猪和9头非转基因克隆猪,这些克隆猪都来源于相同的长白猪胚胎成纤维细胞系。经鉴定这些转基因克隆猪在各个组织器官都有shRNA的表达。这些转基因克隆猪和非转基因克隆猪被运到兰州兽医研究所国家级P3实验室进行体内攻毒实验,以检测其抗口蹄疫病毒感染的能力。实验选择O型Cathay拓扑系毒株Guangdong/CHA/86进行攻毒,按照预实验测定的猪SIDso值确定10 SIDso与100 SIDso两个攻毒剂量。在100 SIDso攻毒剂量试实验中,转基因克隆猪组(TGCS)中有1头猪在整个实验期间完全受到保护,而普通猪阴性对照(NS)组全部表现出临床症状,受到FMDV的感染。4头发病的TGCS的平均起始发病时间比5头发病的NS要晚2.65天,延缓约101.9%(P≤0.05)。TGCS的平均病情恶化时间比NS要延迟1.35天,延迟了96.4(P≤ 0.05)。在10 SIDso剂量组的攻毒实验中,一头TGCS在表现出临床症状三天后就恢复健康了,而所有的5头非转基因克隆猪(Non-TGCS)均表现出临床症状,而且其中一头猪在攻毒后第5天死亡。在两个攻毒剂量的实验中,相比Non-TGCS 和 NS, TGCS的血液和组织中的病毒RNA量明显减少,表明在抵抗FMDV感染的同时,还可能防止后续的疾病传播。在本研究攻毒实验中也用了经过疫苗免疫的普通猪作为阳性对照(VS), VS并不表现明显的临床症状,但是有一头VS猪攻毒后第6天死亡,还有一头VS猪在屠宰后的组织中也发现了病毒RNA。这些结果表明shRNA转基因克隆猪表现出对口蹄疫病毒的抗性。用流式细胞技术分析了猪血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD21+和CD172+免疫细胞的含量,定量PCR技术分析了猪血液中IFN-γ的含量,结果显示,TGCS口NS或Non-TGCS之间没有显著差异。表明,shRNA转基因克隆猪对于FMDV的抗性可能主要来自于RNAi抗病毒途径。利用RNAi技术和转基因克隆方法产生的shRNA转基因克隆猪,对FMDV表现明显的抗性,并且血毒症和组织带毒量也减少。这些结果为利用shRNA技术培育抗传染病转基因猪新品种奠定了重要的基础。