第一部分 明目消朦片成分鉴定及部分有效化合物含量检测目的:对明目消朦片进行成分鉴定并检测其部分有效化合物的含量。方法:应用超高效液相色谱—四极杆一静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC—Q—Orbitrap HRMS）技术,根据化合物的的一级、二级质谱信息,并结合对照品相关质谱数据、质谱谱图数据库和相关文献检索,对明目消朦片的成分进行鉴定并检测其中11种有效化合物的含量。结果:共鉴定49个化合物,包括黄酮类、有机酸类、生物碱类、皂苷类等,并对其中11种化合物进行含量检测进一步验证这些化合物的存在。结论:通过UPLC—Q—Orbitrap HRMS技术可系统、准确、高效地鉴定明目消朦片中的多种化学成分,也为有效成分的含量检测提供了分析方法,为研究其有效成分识别、质量控制、潜在作用机制及指导临床合理用药提供了科学的理论依据。第二部分 明目消朦片对糖尿病大鼠视网膜自噬紊态的影响目的:通过建立糖尿病大鼠模型,探讨不同浓度明目消朦片对糖尿病大鼠视网膜自噬相关蛋白表达的影响。方法:将35只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型对照组、明目消朦片低、中、高剂量灌胃组。除正常对照组外,其余四组大鼠采用STZ60mg/kg的剂量一次性大鼠腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,造模成功1周后开始连续灌胃用药,灌胃期间观察大鼠的一般情况及体重、血糖变化情况,14周后提取各组大鼠视网膜蛋白采用Western Blot法分别检测各组大鼠视网膜组织中自噬蛋白LC3-II和p62的表达,采用HE染色观察各组大鼠视网膜组织形态。结果:1.注射STZ后3天至实验结束,糖尿病模型对照组大鼠比正常对照组体重低,具有统计学差异（P<0.05）;与糖尿病模型对照组相比,造模后2周明目消朦片灌胃组体重均高于糖尿病模型对照组,其中8周、10周、12周、14周低剂量和高剂量灌胃组具有统计学差异（P<0.05）。2.正常对照组大鼠血糖始终维持在正常水平,处于4mmol/L-7mmol/L之间;糖尿病模型对照组血糖始终高于正常对照组,具有统计学差异（P<0.05）,明目消朦片灌胃组血糖与糖尿病模型对照组血糖没有统计学差异（P>0.05）。3.与正常对照组比较,糖尿病模型对照组视网膜组织中LC3-Ⅱ、p62的蛋白表达水平增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,与糖尿病未治疗组相比,明目消朦片灌胃治疗组LC3-Ⅱ、p62的表达水平降低,其中中剂量和高剂量组治疗组具有统计学意义（P<0.05）。4.正常对照组大鼠视网膜各层结构排列整齐,层次清晰。糖尿病模型对照组视网膜神经纤维层增厚、水肿;神经节细胞数量减少,神经节细胞层结构疏松、紊乱,出现空泡样改变;内丛状层水肿明显,可见胶质细胞增生;内核层胞体排列紊乱、疏松,空泡样变性;外核层胞体排列紊乱、疏松,细胞间间隙变大;感光细胞呈丝状排列,尚整齐,可见空泡样改变。视野下能够观察到毛细血管扩张,有的可见充血。明目消朦片灌胃治疗组大鼠视网膜各层结构排列整齐,层次清晰;神经纤维层部分增厚,可见水肿;神经节细胞层可见部分细胞空泡样变性,数量减少;内丛状层形态较完整,可见水肿;内核层胞体整齐排列,核较大,结构完整,染色较深;外丛状层清晰可见;外核层胞体排列整齐致密,染色深;感光细胞内外节层呈丝状排列,可见少量空泡样变性。结论:糖尿病模型对照组LC3-Ⅱ水平上升,说明糖尿病激活视网膜细胞自噬,但是自噬流不通畅,自噬下游受到抑制,溶酶体受损,自噬溶酶体降解减少,导致p62升高。明目消朦片灌胃治疗后,p62和LC3-Ⅱ表达水平均降低,说明明目消朦片可促进溶酶体系统中自噬体的降解,促进视网膜细胞自噬。第三部分 明目消朦片对P13K/Akt/mTOR通路的调控作用目的:通过建立糖尿病大鼠模型,探讨明目消朦片对糖尿病大鼠视网膜自噬调控通路PI3K/Akt/mTOR相关蛋白的表达、血清中炎症因子蛋白水平表达的影响。方法:将32只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型对照组、明目消朦片灌胃组、羟苯磺酸钙灌胃组。除正常对照组外,其他大鼠按照第二部分方法造糖尿病模型,14周后,采用Western Blot法分别检测各组大鼠视网膜组织中自噬蛋白LC3-Ⅱ和p62及上游通路PI3K/Akt/mTOR的表达,免疫荧光及免疫组化确定明目消朦片对视网膜Muller细胞的影响;ERG检测明目消朦片对大鼠视网膜功能的影响;透射电子显微镜观察各组视网膜组织的超微结构;通过蛋白质芯片技术检测明目消朦片对大鼠血清中炎症因子的影响。结果:1.与正常对照组比较,糖尿病模型对照组视网膜组织中LC3-Ⅱ和p62的表达水平增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;与糖尿病未治疗组相比,明目消朦片和羟苯磺酸钙灌胃组LC3-Ⅱ和p62水平均降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与正常对照组比较,糖尿病模型对照组中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表达显著上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。与糖尿病模型对照组比较,明目消朦片灌胃组p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表达显著下调,差异具有统计学意义（P<0.05）;羟苯磺酸钙灌胃组p-Akt和p-mTOR蛋白的表达显著下调,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.经给药3月后,与正常对照组相比,糖尿病模型组在神经纤维层、神经节细胞层以及内网状层内GFAP红色荧光强度均明显增强,免疫组化中可见棕色的长长的突起贯穿内外核层,表现为GFAP表达贯穿视网膜全层的趋势。与糖尿病模型对照组相比,明目消朦片灌胃组和羟苯磺酸钙灌胃组,神经纤维层及神经节细胞层可见GFAP阳性红色荧光染色,荧光均较弱,免疫组化中也可见棕色丝状突起减少。3.与正常对照组比较,糖尿病大鼠的ERG中最大混合反应a波波幅、b波波幅以及OPs2波的波幅均逐渐下降,差异经单因素方差分析具有统计学意义（P<0.05）。与糖尿病模型对照组比较,明目消朦片灌胃治疗后a波波幅、b波波幅以及OPs2波的波幅均有所上升,其中a波波幅和b波波幅具有统计学差异（P<0.05）;羟苯磺酸钙灌胃组a波波幅、b波波幅以及OPs2波的波幅均有所上升,其中b波波幅具有统计学差异（P<0.05）。4.糖尿病模型对照组大鼠Muller细胞的细胞核周胞质内均可见线粒体肿胀,空泡化。此外,内核层其他神经细胞核周胞质肿胀,线粒体肿胀,嵴断裂、空泡化。外核层排列紊乱,核膜内陷,可见细胞核间空隙;光感受器细胞外节膜盘排列紊乱、疏松变形,并发生断裂、溶解,线粒体肿胀,可出现巨线粒体,空泡化明显。毛细血管基底膜增厚,管腔狭窄。明目消朦片灌胃组治疗组大鼠内核层Muller细胞的细胞核周胞质内可见少量线粒体水肿,空泡化,外核层较整齐;光感受器细胞外节膜盘排列整齐,局部可见疏松,未见明显线粒体肿胀及空泡样改变。毛细血管基底膜不均匀,管腔较狭窄。5.通过蛋白质芯片技术检测明目消朦片对大鼠血清中炎症因子的影响,结果显示,与正常对照组比较,糖尿病模型对照组中IL-1 β、IL-4、IL-6、TNF-α、VEGF血清蛋白量的表达显著上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。与糖尿病模型对照组比较,明目消朦片灌胃组IL-1 β、IL-4、IL-6、TNF-α、VEGF血清蛋白量的表达显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;羟苯磺酸钙灌胃组IL-1 β、IL-4、IL-6、TNF-α、VEGF血清蛋白量显著下调,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.明目消朦片灌胃治疗能够下调视网膜组织中LC3-Ⅱ、p62水平和p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达,说明明目消朦片能够有效抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化,促进溶酶体与自噬体的融合,进而增强自噬水平。2.糖尿病早期,视网膜神经胶质细胞发生变化,表现为以Muller细胞为主的胶质细胞的反应性激活,这说明糖尿病早期,由于糖代谢的紊乱,视网膜神经细胞已经受到了伤害。明目消朦片能够抑制糖尿病大鼠视网膜Muller细胞高表达GFAP,对早期糖尿病视网膜神经变性起到保护作用。3.糖尿病模型对照组大鼠ERG最大混合反应a波和b波波幅逐渐下降,b波波幅下降较a波更为明显,说明在DR前期中,即有了感光细胞、双极细胞和Muller细胞的功能变化;OPs波幅基本消失,说明糖尿病模型对照组视网膜缺血缺氧严重。明目消朦片灌胃后,糖尿病大鼠的a波、b波和OPs波的波幅均有升高,说明明目消朦片对糖尿病大鼠的视网膜功能有保护作用,这种保护作用可能与改善视网膜的血液循环有关。4.糖尿病模型对照组血清蛋白炎症因子升高,而明目消朦片灌胃后血清蛋白炎症因子降低,这种降低的结果可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关,从而使细胞释放炎症因子减少。