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研究背景:在人类和动物乳腺癌组织中,广泛存在eIF4E结合蛋白4EBP1的过度磷酸化,致使eIF4E的可用度增加,eIF4F复合物的活性上调,从而选择性地上调了多种促细胞增殖分子、抗细胞凋亡分子、促细胞迁移和侵袭分子、放化疗抵抗相关分子以及促血管新生分子的表达,促进了肿瘤的生长和血管化。目前,eIF4F复合物已被视为治疗乳腺癌的关键靶点之一。eIF4E与4EBP1结合与否是控制eIF4F翻译起始复合物装配的关键因素,这种结合能力是由mTORC1介导的4EBP1的磷酸化调控的。在前期研究中,我们设计了同时删除RAIP基序和TOS基序的磷酸化缺陷型4EBP1突变体4EBP1D,研究发现这样的缺陷型4EBP1D不能被磷酸化失活,未被磷酸化的4EBP1D与eIF4E有效结合,将eIF4E封闭隔离,从而阻断了eIF4F复合物的装配,抑制了乳腺癌细胞的增殖和迁移,促进其凋亡。但是,值得注意的是,eIF4F复合物在机体内的免疫系统和造血系统中发挥着巨大的作用,阻断eIF4F复合物的功能可能会引发严重的毒副作用。因此如何实现特异性抑制乳腺癌细胞中的eIF4F复合物活性是当下肿瘤治疗研究的焦点。近年来有研究表明,乳腺癌组织中CXCR4的表达水平明显升高,而且高表达CX-CR4的乳腺癌患者预后极差,同时CXCR4的过度表达与乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力密切相关。趋化因子CXCL12是CXCR4的配体,删除人CXCL12的55-68位氨基酸序列或将氨基末端第2位的脯氨酸突变为甘氨酸,均能在保留其与CXCR4结合能力的同时使其丧失激活CXCR4的能力。实验目的:本研究拟以乳腺癌组织中高表达的CXCR4为靶点,探讨使用无受体激活作用的CXCL12P2G突变体介导磷酸化缺陷型4EBP1突变体4EBP1D靶向治疗乳腺癌的效果和安全性,以期为建立一种高效安全的乳腺癌基因治疗策略提供实验依据。实验方法:1)采用RT-PCR以及基因克隆技术分别构建能够分泌表达CXCL12P2G突变体、蛋白转导功能域-4EBP1D突变体和CXCL12P2G突变体-4EBP1D突变体融合蛋白的真核表达载体pCXCL12D、pSecX-4EBP1D、pCXCL12-4EBP1D,使用二氧化硅吸附法大量提取质粒并用Triton X-114等温法将质粒中的内毒素去除。2)使用小鼠4T1细胞建立乳腺癌的动物模型,在Invivojet PEI介导下,在体转染空载体pIRES2-EGFP、pCXCL12D、pSecX-4EBP1D、pCXCL12-4EBP1D,比较CXCL12P2G突变体、蛋白转导功能域-4EBP1D突变体、CXCL12P2G突变体-4EBP1D突变体融合蛋白对乳腺癌的基因治疗效果。3)治疗结束后,分别收获空载体对照组、CXCL12D治疗组、4EBP1D治疗组和CXCL12-4EBP1D治疗组小鼠的瘤体以及心、肝、肺、肾四类重要脏器,称重,并制作石蜡切片和HE染色,进一步评价基因治疗效果以及对重要脏器的毒副作用。实验结果:经过为期19天的治疗发现,与空载体对照组相比,CXCL12D治疗组、4EBP1D治疗组和CXCL12-4EBP1D治疗组中小鼠肿瘤的增长速度均减缓,并且CXCL12-4EBP1D治疗组的疗效最为显著。HE染色结果显示4EBP1D治疗组中小鼠的肝脏和肾脏出现了明显的病变特征,而CXCL12D治疗组以及CXCL12-4EBP1D治疗组中小鼠的脏器在实验观察期间均未发现明显的病变。