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肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的病理类型同时也是全球第四大癌症相关死亡原因。它属于高度炎症相关的癌症类型,调节性细胞死亡（RCD）可在HCC的“炎症-致癌”途径中起到肿瘤抑制的作用。铁死亡是一种新型RCD,可规避致癌过程的抗凋亡信号有利于抑制HCC进展。铁死亡性细胞形态表现为线粒体大小、外膜及嵴的改变,肿瘤抑制因子p53的逆行信号是线粒体早期功能障碍的提示信号,参与细胞生存和死亡之间的调节,但该逆行信号的激活机制是否与铁死亡的早期形态改变有关联尚不清楚。铁死亡性细胞生化特征包括谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）下降,含多不饱和脂肪酸的磷脂的过氧化和氧化还原活性铁的增加。其中,GPX4是一种含硒蛋白,其硒代半胱氨酸在氧化还原反应中具有更高的反应性及效率,与肿瘤细胞的氧化还原状态及肿瘤细胞耐药性密切相关。此外,GPX4的不同胞内定位可发挥不同作用,已有计算机模拟模型发现线粒体定位的GPX4可调控线粒体的信号分子介导铁死亡的发生,但尚无实验学证据。磷酸化/去磷酸化修饰作为肿瘤细胞中常见的翻译后修饰（PTMs）可调控胞内蛋白分布及功能,对细胞的RCD信号也至关重要。然而,PTMs是否参与GPX4线粒体定位的改变,以及这一改变是否经由线粒体功能障碍信号调控铁死亡的发生有待研究。目的:通过建立铁死亡诱导性肝癌细胞模型,探明GPX4的表达、分布参与调控线粒体p53的分布、转位情况;探讨线粒体p53逆行入核介导铁死亡的新机制;结果为靶向GPX4干预经由调节其特定磷酸化位点状态介导肝癌细胞铁死亡影响抗肿瘤敏感性提供实验依据。方法:（1）人群数据分析:采用GEO数据库（GSE76427、GSE38476）和TCGA数据库（TCGA-LIHC）,分析HCC病例的癌旁组织（ANTTs）和原位肿瘤组织（PTs）中铁死亡相关基因、蛋白磷酸酶2A（PP2A）各亚基基因mRNA水平及二者之间的相关性。（2）体外试验:采用永生化人正常肝L02细胞为对照细胞,实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）及蛋白免疫印迹（WB）检测人肝癌HepG2、MHCC97H、Huh-7、QGY7703和Hep3B细胞检测GPX4基因mRNA水平和蛋白表达筛选体外试验细胞;给予人肝癌HepG2、MHCC97H、Huh-7 和 Hep3B 细胞 Sora（10 μmol/L,24 h）处理分别建立铁死亡不同敏感程度细胞模型,给予Fer-1（1 μmol/L,24 h）干预建立铁死亡抑制模型并检测相关指标。①透射电子显微镜（TEM）、线粒体膜电位（JC-1探针标记法）、激光共聚焦显微镜免疫荧光法（IF）检测线粒体形态和功能改变;②MTS颜色反应法检测细胞增殖/功能活性;③流式细胞术（FCM）检测脂质过氧化（LPO）探针C11 BODIPY标记的发生LPO的细胞比例;④WB检测PP2A-B55β、GPX4、p53总蛋白和不同亚组分蛋白表达;⑤邻位连接实验（PLA）、IF检测B55β与GPX4蛋白空间位置的临近改变;⑥线粒体免疫共沉淀（Co-IP）检测GPX4与p53蛋白在线粒体上的分布及其蛋白直接相互作用;⑦转染TP53高表达质粒及TP53-ΔNLS质粒于Hep3B细胞建立p53回补模型验证p53蛋白入核作用,构建GPX4高磷酸化（D）或低磷酸化（A）的HepG2和Huh-7细胞株验证GPX4磷酸化位点的功能学作用,构建B55β高表达的HepG2细胞模型验证B55β对GPX4的调控作用。（3）体内试验:采用雌性BALB/c裸小鼠（SPF级,4-6周龄）,于皮下注射HepG2-PPP2R2B细胞建立B55β高表达裸小鼠模型,并以HepG2-pBabe细胞注射建立对照裸小鼠模型开展体内试验研究验证B55β对铁死亡的作用。于接种第15天起每隔1天给予裸小鼠尾静脉注射生理盐水（NS）和索拉非尼（Sora）处理,共5次。每2天常规记录小鼠体重和原位移植瘤生长情况。于接种第24天处死裸小鼠,剥离瘤组织测定体积及质量后进行下述指标检测:①WB检测瘤组织总蛋白,胞浆、线粒体组分及胞浆、细胞核组分中铁死亡相关蛋白（B55β,GPX4和p53）表达;②5,5’-二硫硝基苯甲酸（DTNB）速率比色法检测瘤组织中还原型谷胱甘肽（GSH）含量;③硫代巴比妥酸（TBA）颜色反应法检测瘤组织中丙二醛（MDA）含量;④免疫组化（IHC）检测瘤组织中铁死亡相关蛋白表达与分布;⑤TEM检测线粒体形态改变。结果:（1）人群数据库分析:GEO数据库（GSE76427、GSE38476）和TCGA-LIHC数据库分析显示,与ANTTs样本相比,PTs病例中GPX4基因的mRNA水平升高、PPP2R2B基因mRNA水平降低（P<0.05）,且GPX4与PPP2R2B之间存在负相关（P<0.05）。（2）体外试验:①体外试验细胞株选择:与L02细胞相比,人肝癌HepG2、MHCC97H细胞中GPX4基因mRNA水平降低（P<0.05）,GPX4蛋白表达减少,人肝癌Huh-7、QGY7703、Hep3B细胞中GPX4基因mRNA水平升高（P<0.05）,GPX4蛋白表达增加,因此后续选取人肝癌HepG2和MHCC97H细胞进行实验;②铁死亡模型结局指标检测:与对照组相比,铁死亡诱导性细胞线粒体外膜电子密度增加,线粒体嵴减少或消失,线粒体膜电位损失,细胞总体及线粒体LPO增加;细胞增殖/功能活性下降（P<0.05）,联合铁死亡抑制剂Fer-1后细胞增殖/功能活性回升（P<0.05）,而联合其他细胞死亡形式抑制剂（Z-VAD,Nec-1）无明显改变;B55β总蛋白及线粒体组分蛋白水平升高,GPX4总蛋白及线粒体组分蛋白水平下降,p53线粒体组分蛋白减少,细胞核组分增加;③p53蛋白入核作用验证:与对照组细胞相比,转染TP53高表达质粒的Hep3B细胞增殖/功能活性降低（P<0.05）,LPO 水平升高（P<0.05）,而转染TP53-ΔNLS质粒的Hep3B细胞无明显变化;④GPX4磷酸化位点功能学验证:与对照HepG2-pBabe细胞相比,低磷酸化HepG2-GPX4-S2A细胞增殖/功能活性降低（P<0.05）,总体LPO水平升高（P<0.05）,且与高磷酸化HepG2-GPX4-S2D细胞相比,线粒体p53核转位增加;这一现象在铁死亡耐受Huh-7细胞中同样表现为:与Huh-7-pBabe细胞相比,低磷酸化Huh-7-GPX4-S2A细胞增殖/功能活性下降（P<0.05）,总体LPO增加（P<0.05）,且与高磷酸化Huh-7-GPX4-S2D细胞相比,线粒体p53转位入核增加;⑤B55β对GPX4调控作用验证:邻位连接实验（PLA）观察结果显示B55β与GPX4蛋白空间位置临近,二者在线粒体共定位减少,提示B55β与GPX4的互作可能影响GPX4蛋白在线粒体的表达;与HepG2-pBabe细胞相比,高表达B55β的HepG2细胞中经Sora处理后B55β蛋白水平升高,GPX4蛋白水平降低。（3）体内试验:与给予NS处理的对照组裸小鼠相比,给予药物处理的对照组裸小鼠、给予NS和药物处理的B55β高表达组裸小鼠中,均观察到肿瘤体积增长较慢,检测结果显示肿瘤质量和体积减少,B55β蛋白水平升高,GPX4蛋白水平降低,GSH含量减少（P<0.05）,MDA含量增高（P<0.05）,提示B55β可经由铁死亡作用抑制肿瘤生长。结论:研究发现GPX4Ser2去磷酸化可经由其线粒体分布调控线粒体p53转位至细胞核参与诱导铁死亡,且PP2A在上游参与了该过程;阐明了经由线粒体至细胞核的细胞器间通讯参与介导铁死亡信号的新分子机制。结果为筛查GPX4功能性去磷酸化修饰位点及探讨PP2A在肝致癌作用中的分子调控机制提供线索,也为靶向GPX4介导肝癌细胞铁死亡依赖性肿瘤化学预防策略提供实验依据。