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第一部分：重症急性胰腺炎并发肝内胆管细胞损伤的研究目的：探讨重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肝内胆管组织病理学变化及胆管细胞凋亡情况,研究巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在SAP大鼠肝内胆管细胞损伤中的表达及作用。方法：采用SPF级雄性Wistar大鼠,随机分为4组(N=12)。假手术组(SO组),重症急性胰腺炎组(SAP3h、6h、12h三个亚组),通过胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液制备大鼠SAP模型。分别测定各组大鼠血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIPA)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBiL)及总胆汁酸(TBA)水平,应用HE染色法观察各组大鼠胰腺、肝脏及肝内胆管组织病理学改变,应用免疫组化S-P法检测肝内胆管细胞MIF表达情况,TUNEL法检测大鼠肝内胆管细胞的凋亡率。结果：SAP大鼠血清AMY、LIPA、ALT、ALP、TBA、TBIL水平明显升高,肝功能指标中ALP、TBA、TBIL增高明显,表明胆管细胞有损伤存在,与SO组比较,差异有显著意义(P<0.05)。SAP组大鼠胰腺、肝脏及肝内胆管细胞病理损伤明显,病理评分伴随胰腺炎病情进展逐渐升高,与SO组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果显示SAP各组大鼠肝内胆管细胞MIF表达较SO组表达明显增高(P<0.05),差异有显著意义。TUNEL法检测发现SAP组大鼠肝内胆管细胞凋亡率较SO组明显增加(P<0.05),差异有显著意义。结论：SAP时,大鼠肝内胆管细胞出现不同程度功能及病理损伤,肝内胆管细胞中MIF表达水平随SAP的病程进展出现明显升高趋势,肝内胆管细胞的凋亡率亦逐渐增高,表明MIF可能在SAP并发肝内胆管细胞损伤的发病过程中发挥重要作用。第二部分：巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在重症急性胰腺炎并发肝内胆管细胞损伤中的作用机制探讨目的：研究SAP时大鼠肝内胆管细胞中MIF基因表达变化,P38-MAPK信号通路相关炎性因子的蛋白表达水平,探讨MIF在SAP大鼠肝内胆管细胞损伤中的可能作用机制。方法：SPF级雄性Wistar大鼠,随机分为4组(N=12)。SO组、SAP组(3h、6h、12h三个亚组),造模方法同第一部分。免疫组化法检测P38在肝内胆管细胞的表达,Real-time PCR法检测大鼠肝内胆管细胞MIF mRNA, TNF-a mRNA表达水平,Western-blot法检测肝内胆管组织P38、P-P38、NF-κB p65、TNF-a的蛋白表达水平,并应用ELISA法检测各组大鼠肝内胆管组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量,分析SAP时MIF的表达与P38-MAPK信号通路相关炎症蛋白表达变化的关系。结果：免疫组化结果显示SAP组大鼠肝内胆管细胞P38明显阳性表达,主要表达于肝内胆管细胞核,其表达量较SO组明显增高,差异有显著意义(P<0.05)。Real-time PCR结果显示SAP组大鼠肝内胆管细胞中MIF mRNA、TNF-a mRNA表达均较SO组明显上升(P<0.05)。Western-blot结果表明：SAP组肝内胆管细胞中P-P38. NF-κB p65以及TNF-a的蛋白表达量均较SO组呈增强趋势,差异有显著意义(P<0.05)。ELISA法检测TNF-a、IL-1β、IL-6含量,结果发现SAP组肝内胆管组织中TNF-a、IL-1β、IL-6的含量较SO组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论：SAP时,MIF可通过激活大鼠肝内胆管细胞中P38-MAPK信号通路,使肝内胆管细胞NF-κB活化,并进而导致其下游炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6的大量释放,从而促进肝内胆管细胞的炎症反应及病理损伤,加重SAP病情进展。第三部分：MIF抑制剂ISO-1对重症急性胰腺炎并发肝内胆管细胞损伤的保护作用研究目的：观察MIF抑制剂ISO-1对SAP大鼠肝内胆管细胞病理和超微结构的影响,检测ISO-1治疗后肝内胆管组织NF-κB活性及其下游炎症因子的表达变化,探讨ISO-1对SAP大鼠肝内胆管细胞损伤的保护作用机制。方法：48只SPF级雄性Wistar大鼠,随机分为4组(N=12),SO组、SAP组、ISO-1治疗组(ISO-1+SAP)和ISO-1药物对照组(ISO-1+SO)。ISO-1治疗组于SAP造模前30min经腹腔注射MIF抑制剂ISO-1溶液(0.1ml/100g)。ISO-1药物对照组在假手术前30min经大鼠腹腔注射与ISO-1治疗组等容量的ISO-1溶液(0.1m1/100g)。各组于造模后12h剖杀大鼠,测定各组大鼠血清AMY、肝功能指标,并观察胰腺、肝脏及肝内胆管组织病理学变化,电镜观察肝内胆管细胞超微结构变化,ELISA法检测TNF-β、IL-1β、IL-6在各组大鼠肝内胆管组织中的含量,免疫组化法检测MIF、P38在肝内胆管细胞的表达,Real-time PCR法检测大鼠肝内胆管细胞MIF mRNA、TNF-αmRNA表达,Western-blot法检测肝内胆管组织P38、P-P38、NF-κB p65、TNF-α的蛋白表达水平。结果：SAP大鼠在给予ISO-1预处理后,大鼠血清中AMY、LIPA以及肝功能指标均显著降低,胰腺、肝脏及肝内胆管病理损伤程度明显减轻,电镜下见大鼠肝内胆管细胞超微结构损伤也明显缓解。Real-time PCR检测结果显示：ISO-1治疗组肝内胆管细胞MIF mRNA、TNF-αmRNA表达水平较SAP组均有明显下降(P<0.05)。免疫组化结果：SAP组中P38表达活性较SO组增强,且主要表达于肝内胆管细胞核,而ISO-1干预后其表达IOD值较SAP组下降,活性降低,各组间比较差异有显著意义(P<0.05)。Western-blot结果显示：与SAP组比较,ISO-1治疗组肝内胆管组织中P-P38、NF-κB p65、TNF-α的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。ELISA法检测大鼠肝内胆管组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,结果显示ISO-1治疗组上述各炎症相关因子含量较SAP组显著下降(P<0.05)。各项指标检测结果显示ISO-1药物对照组与SO组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：MIF抑制剂ISO-1可有效抑制SAP大鼠肝内胆管细胞MIF的表达,从而阻断P38-MAPK信号通路,降低P38磷酸化的活性,抑制肝内胆管细胞中NF-κB炎症通路激活,下调其下游炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6的表达及释放,从而发挥对SAP并发肝内胆管细胞损伤的保护作用,缓解SAP病情进展。