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猪流感( Swine influenza, SI)是由猪流感病毒( Swine influenza virus, SIV)引起的不同日龄、性别和品种猪的一种急性、热性和高度接触性的呼吸道传染病。其特征为疾病突发,高热,精神沉郁,食欲废绝,呼吸困难,阵发性咳嗽。SI的病死率不高,病猪可迅速康复,但是随着集约化养猪规模的不断扩大,SI对养猪业构成了较大的威胁。1918年美国首次报道了SI的暴发,1930年Shope从猪体中分离到了H1Nl亚型SIV。迄今为止,SI已遍布美、欧、亚、非等世界各地。SI除具有兽医学意义外,更为重要的是生态学和公共卫生意义。目前,SI已成为研究的热点。研究快速、科学、准确的诊断方法对于本病的检测和控制具有很大的意义。本研究用接种鸡胚的病毒增殖方法大量增殖分离株A/swine /Hangzhou/1/2006 (H9N2),增殖病毒经差速离心进行纯化,经超速离心浓缩。根据Genbank发表的SIV结构蛋白M1、NP和非结构蛋白NS1基因核苷酸序列,设计1条通用引物Unit,进行反转录获取cDNA;设计特异性引物Pm1/ Pm2、Pnp1/ Pnp2、Pns1/ Pns2用以扩增M1、NP和NS1基因。通过PCR技术,从病毒基因反转录产物cDNA中扩增出病毒结构蛋白M1、NP和非结构蛋白NS1目的基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,然后定向克隆到表达载体pET-28a中。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。将重组质粒pET-M1,pET-NS1和pET-NP转化到表达宿主菌BL21 (DE3)/ Rosetta TM(DE3)中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,高效表达了M1、NP和NS1蛋白,分子质量约为31.4 kD、55.1kD和27kD。经Western-Blot检测表明,表达的重组蛋白均能够被SIV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。此结果为SI新型免疫学诊断试剂以及亚单位疫苗的研制奠定了基础。用纯化的H9N2亚型SI可溶重组NP蛋白作为包被抗原,建立了检测SI抗体的间接ELISA方法,并确定了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为12.5μg/ml,37℃1 h加4℃过夜,血清(1∶40)和SPA (1∶10000)分别在37℃温育40 min,底物溶液37℃显色15 min。经重复性试验、交叉试验、竞争抑制试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高;利用TG-ROC软件确定了自制ELISA (NP-ELISA)酶标板的临界值为0.20,特异性和敏感性分别为95.83%和91.43%。与美国IDEXX试剂盒相比较,符合率为94%,无显著性差异。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本356份,总阳性率为35.40%。为进一步组装成诊断试剂盒奠定物质基础,为SIV的诊断与监测提供了一种良好的技术手段。