研究背景:肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,据估计美国2009年肺癌死亡率为53.80/10万。根据广州市死亡登记的数据,1972-1973年广州市城区居民肺癌死亡率为11.61/10万,而2000 - 2002年肺癌死亡率为48.79/10万,30年来死亡率上升了3倍;上海、天津等城市的报告也是如此,表明肺癌已成为我国居民面临的最主要健康问题之一。尽管大量的流行病学研究发现了肺癌的一些危险因素,如吸烟、空气污染、电离辐射、肺结核、重金属毒物及冶炼工人职业暴露等,但是肺癌具体发病机制仍未明了。为了科学地防治肺癌,有必要深入了解这些危险因素导致肺癌的有关机制。上述这些危险因素对机体细胞而言都是外界刺激因素。细胞外的这些有害刺激信号,均可激活胞浆蛋白激酶,常见的蛋白激酶有丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、蛋白激酶C（PKC）、PKA、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CAMK）等。目前认为MAPK信号传导通路是其中最重要的蛋白激酶信号之一。MAPK信号传导通路是经典的三级丝/苏氨酸蛋白激酶系统,由MAPKKK（MAPKK激酶）、MAPKK（MAPK激酶）及MAPK分子构成。MAPK信号通路以级联方式依次活化上述三种激酶,并将细胞外信号逐级放大并传导到细胞内,通过不断磷酸化下游靶蛋白而产生效应。MAPK信号传导通路可大致分为几条并行的分支:ERK（extracellular signal-regulated kinase）信号通路、c-Jun N端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase,JNK/SAPK）信号通路、p38 MAPK信号通路,及ERK5信号通路。虽然各条MAPK信号通路均有相对特异的底物和生物学效应,但在肿瘤发生中同时在MAPK信号各分支通路之间、及MAPK与其他信号传导通路之间存在着复杂的交互作用,如与JAK-STAT（信号传导及转录激活因子）通路、PKA通路、激素信号（尤其是雌激素信号系统）、磷脂酰肌醇3（PI3）激酶及Ca离子信号通路等的交互作用等。这些信号通路交互作用的形式有相互协同、相互抑制等多种,往往体现在不同信号通路间可有共同的信号调节分子,而这些调节分子又可对不同信号通路分别产生激活/抑制等不同作用。所以要充分认识理解MAPK信号通路导致肿瘤的机制,需深入研究MAPK信号通路中多信号途径的关键汇聚点在肿瘤的发生、发展过程的作用。丝裂原活化蛋白激酶激酶4 （mitogen-activated protein kinase kinase 4,又称MKK4、MAP2K4、MEK4、JNKK1及SEK1等）就是MAPK信号通路中的关键汇聚点和关键调节分子。细胞在受到生长因子、激素、炎症分子及各种应激刺激后,可通过Ras依赖或非Ras依赖的两条途径,经多种MAPKKK激酶,如MEKK1⁴ （ MEK激酶1⁴ ）、TAK1 （ TGF-activated kinase 1 ）、MUK（MAPK-upstream protein kinase）、Tpl-2 （Tumor progression locus 2）、MLK-3 （Mixed lineage kinase 3）、ASK1（Apoptosis signal-regulating kinase 1）、MST（mammalian STE20-like kinase）等激活MKK4蛋白。可见MKK4分子可能是多种上游致癌应激信号途径的汇聚点。同时,MKK4又可激活JNK和p38 MAPK两条并行的MAPK信号通路。JNK和p38都可影响众多的核内转录因子,如c-Jun、ATF-2（激活转录因子-2）、Elk-1（Ets-like protein 1）、p53、DPC4（deletion target in pancreatic carcinoma 4）、NF-AT4（核因子-T细胞激活）、C/EBP家族成员Chop（C/EBP homology protein）,及Max等的活性;与JNK不同的是,p38还可影响胞质底物活性,如MK2/MK3（MAPK途径激活的蛋白激酶2/3）,及热休克蛋白HSP25/HSP27等。MKK4可直、间接调节上述细胞核内外多种关键的信号传导分子,进而调节细胞凋亡、炎症反应、细胞增殖等过程,与肿瘤的发生相关。由于下游效应分子众多,MKK4分子参与肿瘤发生的途径是非常广泛和复杂的。目前大量的研究提供了MKK4基因与肿瘤发生相关的直接证据:在肺癌细胞系和胰腺癌细胞系可见MKK4基因编码区的纯和性缺失,并且在大约5%的人各种肿瘤组织中可检测出导致MKK4基因功能丧失的突变。还发现MKK4基因是前列腺癌和卵巢癌转移的抑制因素,且该基因的低表达与胃癌、前列腺癌及卵巢癌的预后不良相关。由此,不少学者认为MKK4基因可能是抑癌基因。但也有学者持相反的学术观点。上述众多的研究报道提示深入研究MKK4基因有助于进一步理解肿瘤发病机制,为肿瘤的预防和治疗打下科学基础。然而即使是重度吸烟者其终身也仅15%的概率发生肺癌,并不是所有暴露于吸烟、空气污染、放射线等肿瘤危险因素的人群都会罹患肿瘤,提示具有不同遗传背景的人群其肿瘤易感性不同。鉴于在肿瘤发生过程中常有MKK4基因的缺失和突变,有必要深入研究MKK4基因遗传变异与人群肿瘤发病的关系。人MKK4基因（Genomic Accession No: NM₀03010.2）位于第17号染色体17p11.2位置,基因全长>120 kb ,含一个1.6 kb的启动子。该基因mRNA全长3826 bp,共11个外显子,编码399个氨基酸的MKK4蛋白。MKK4基因是一个含丰富遗传变异的基因,尤其在其启动子区域。研究团队曾研究MKK4基因启动子的遗传变异rs382639（2-1304T>G,相对于翻译起始位点-1304nt）及rs3809728（-1044A>T）与中国南方人群直肠癌易感性的关系,发现携带-1304G变异基因型者患肿瘤危险性下降,提示MKK4基因启动子区域存在潜在的功能性遗传变异位点。因为文献报道肺癌的各种主要危险刺激均可激活MKK4蛋白及MAPK信号通路的其他各种分子,而肺癌中又常见MKK4基因表达的改变,推测MKK4基因启动子的遗传变异可改变该基因的表达及功能,进而与人群肺癌发生相关。科学假说:基于对环境致癌物暴露可通过蛋白激酶MAPK信号通路影响细胞凋亡、细胞增殖及转化而导致肿瘤发生的认识,针对MAKP信号通路的关键调节基因MKK4启动子区域存在潜在的功能性遗传变异,提出这些遗传变异可能通过调控MKK4基因的表达和功能而影响人群肺癌易感性的研究假说。研究目的:为了探讨MKK4基因启动子区遗传变异位点与我国南方人群肺癌发病的关系,本研究采用分子流行病学方法在1056名新诊断的肺癌患者及1056名无肿瘤正常对照中检测了MKK4基因启动子遗传变异-1304T>G和-1044A>T的基因型,采用SAS 9.13软件进行多因素非条件Logistic回归,分析上述基因变异与肺癌发病的关联;在分层分析中探讨不同亚人群中MKK4基因遗传变异与肺癌关联度的不同,并采用相加/相乘交互作用统计模型进一步探讨基因-环境交互作用在肺癌发病中的作用;应用Western Blot试验和萤光素酶报告基因试验等一系列体外功能试验阐述MKK4基因启动子区遗传变异与肺癌发病关联的分子实质,为肺癌高危人群的筛选和预防提供科学依据。材料和方法:本研究采用病例-对照的方法,于2007年3月至2009年3月间在广州市区及周边共五所医院收集广州及周边地区1056个经病理学诊断的新发肺癌患者,按性别相同、与患者年龄（±1岁）成组配比,从同期参加社区健康体检项目10000名体检者中选取1056例无肿瘤的正常健康对照。研究对象均为无血缘相关的汉族人群,且在广州地区生活至少10年以上,半年内无输血史者。由专业培训人员询问病例和对照人群,并记录人口学基本特征,包括吸烟、饮酒、癌症家族史、职业史等。经签署知情同意书后,病例和对照皆采取外周静脉血5ml,并提取DNA进行后续分子流行病学检测。为选择合适的遗传变异位点分析MKK4基因与人群肺癌易感性的关联,本研究测序检测了随机选取的30名正常人MKK4基因启动子核酸序列,发现在中国南方人群中该基因启动子区域存在4个常见多态性位点[定义为低等位基因频率（minor allele frequency, MAF）>5%] : -1304T>G （rs3826392）、-1044A>T （rs3809728）、-641C>G （rs2190853）及-284T>C （rs9892151）。进一步连锁（linkage disequilibrium,LD）分析发现-1044A>T、-641C>G及-284T>C这3个位点处于完全连锁状态（任两者之间r2 = 1.00,D’= 1.00）。而这3个位点与-1304T>G均处于不完全连锁状态（r2 < 0.80, D’< 0.80）。本研究选取-1304T>G和-1044A>T这两个位点进行中国南方人群肺癌易感性的研究。在1056对肺癌病例-对照人群中,采用TAQMAN法检测了-1304T>G和-1044A>T这两个位于MKK4基因启动子的遗传变异;其中使用TAQMAN MGB（minor groove binder）探针替代了常规TAQMAN探针（TAMRA探针）,以升高荧光探针Tm值、提高检测分辨率。采用SAS 9.13软件进行多因素非条件Logistic回归,校正混杂因素的影响,分析上述基因变异与肺癌发病的关联;调整的因素包括性别、年龄及吸烟、饮酒状态、体重指数（body mass index, BMI）,以及癌症家族史和肺癌家族史,以获得所研究基因位点对肺癌易感性的真实效应。进一步采用分层分析,比较具有不同年龄、性别、吸烟及饮酒状态、BMI及癌症家族史的研究亚组中MKK4基因遗传变异与肺癌易感性关联性的不同;并采用相加/相乘交互作用模型,分析基因位点与上述环境因素在肺癌发生中的交互作用:当OR 11>OR 10×OR 01时,表示基因位点与环境因素存在交互作用;OR 11为两种因素均存在时的OR值,OR10为只有变异型基因位点存在时的OR值,OR01为只有某环境因素存在时的OR值。为验证MKK4基因不同基因型在肺组织中对基因编码蛋白MKK4表达水平的影响,随机收集本研究中经手术治疗30例患者切除的肺癌组织,应用Western Blot法在肺癌组织中检测MKK4蛋白表达水平,同时检测β-actin作为内参以标化MKK4蛋白表达水平。采用单因素方差分析法比较携带不同基因型肺癌患者其肿瘤组织中的MKK4蛋白表达,并采用线性回归模型调整性别、年龄及吸烟、饮酒状态等混杂因素下携带不同基因型肺癌组织的MKK4蛋白表达水平。线性回归模型还用于分析MKK4基因多态位点对肺癌组织中MKK4蛋白表达影响的等位基因剂量—效应关联。为进一步检测MKK4基因多态性不同等位基因对启动子转录活性的影响,本研究采用基因克隆技术构建包含MKK4基因启动子区域1612bp片段（相对于转录起始位点-1528—+84 bp）的报告基因质粒。将萤光素酶报告质粒转染16HBE（永生化人支气管上皮细胞株）、A549（人肺腺癌细胞株）及L78（人肺鳞癌细胞株）等3种人肺细胞株,检测质粒的萤光素酶（Luciferase）活性水平;其中加入pGL3-basic质粒作为阴性对照,加入海肾萤光素酶质粒（pRL-TK）作为内参,以海肾萤光素酶水平计算含MKK4基因不同等位基因型质粒Luciferase活性水平的相对值。采用t检验分析体外荧光素酶报告基因试验的结果。本研究经Western Blot试验和萤光报告基因试验等体外试验研究,阐明了MKK4基因启动子的遗传变异与肺癌易感性关联的分子实质。研究结果:本研究包括1056例原发性肺癌病例与1056例正常对照。肺癌病例按病理类型分类,其中36.4%的患者为腺癌（384例）,34.9%为鳞癌（369例）,4.1%为大细胞肺癌（43例）,12.1%为小细胞肺癌（128例）,12.5%为其他类型（如腺鳞癌、混合型肺癌,132例）;按2009年版国际肺癌研究会分期项目（IASLC）标准判断肺癌的分期,1056例肺癌患者中病理I^IV期的比例分别为14.5%（154例）、9.0%（94例）、31.5%（333例）及45.0%（475例）。经χ2检验发现,1056例正常健康对照的性别、年龄与1056例病例之间无差异（P值分别为1.000和0.931）。进一步单因素分析几个常见的肺癌危险因素,发现吸烟、BMI是肺癌的危险因素（P值分别为0.028和<0.001）,但本研究中癌症家族史、肺癌家族史、饮酒与肺癌发病无关（P值分别为0.942、0.150和0.916）。通过TAQMAN法检测MKK4基因的-1304T>G和-1044A>T基因型频率,以拟合优良度χ2检验（p2+2pq+q2=1）进行哈迪-温伯格平衡（ Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE）检验,发现在对照组中-1304T>G和-1044A>T两个位点基因型频率均符合HWE（P值分别为0.704及0.688）,提示基因型鉴定结果符合随机人群分布标准。进一步采用2LD软件和SAS/Genetics软件中的PROC ALLELE过程分析本研究对照人群中MKK4基因两个多态性位点的连锁关系,显示这两个基因位点处于很弱的连锁状态（D’= 0.072,r2 = 0.004）,提示这两个基因位点可独立地与人群肺癌易感性发生关联,且不适宜于进行HAPLOTYPE（染色体单倍型）分析。采用χ2检验发现,MKK4基因的-1304T>G基因型频率在肺癌与对照中的分布差异有显著性（在病例中TT、TG、GG基因型频率依次为:65.5%、30.2%、4.3%;而在对照中频率依次为57.3%、35.9%、6.8%;χ2=15.079,P<0.001）。进一步采用多因素非条件Logistic回归分析,发现携带-1304TG变异基因型个体发生肺癌的危险性比TT基因型携带者下降26%（adjusted OR=0.74;95% CI =0.61–0.90;P=0.002）,而携带-1304GG变异基因型个体的危险性下降38%（adjusted OR = 0.62;95% CI= 0.41– 0.94;P = 0.024）;并且发现,-1304G变异基因型的保护作用存在显著的等位基因剂量—效应关联（adjusted P <0.001）。将三种基因型进行二分类处理,以-1304TT基因型为参照,携带-1304G变异基因型（-1304TG+GG）者罹患肺癌的危险性显著下降（adjusted OR = 0.72,95% CI = 0.60 - 0.87,P = 0.003）。同时进行统计效能分析,在双侧统计α为0.05水平及OR为0.72水平时,发现-1304G变异基因型（-1304TG+GG）与肺癌易感性关联的统计效能达到95.53%;并计算假阳性结果报告率（FPRP）,发现验前概率为0.01水平时,假阳性概率0.06,低于预设水平0.20。然而对于基因多态位点-1044A>T,未发现其基因频率和等位基因频率在病例和对照存在显著性差异（P = 0.703和P = 0.426）,提示与南方人群肺癌易感性无关联。进一步分层分析,探讨不同亚人群中MKK4基因遗传变异与肺癌关联度的不同;在分层分析中将三种基因型进行二分类处理（-1304TG+GG vs. -1304TT）,以增加统计效能。发现-1304G变异基因型（-1304TG + GG）与人群肺癌的关联性在不同年龄（大于或小于60岁）、性别、吸烟及饮酒状态、肿瘤家族史及肺癌家族史,及不同肿瘤病理分型的各个亚组间均无差别（所有P值均>0.05）。但等位基因-1304G的保护作用在低体重指数（BMI<18.0）（adjusted OR = 0.27;95% CI = 0.13– 0.53;P <0.001）或体重正常的患者更明显（18.0≤BMI≤25.0）（adjusted OR = 0.73;95% CI = 0.59– 0.90;P = 0.003）,而在超重或肥胖的患者（BMI >25.0）其保护作用受到抑制（adjusted OR = 1.01;95% CI = 0.63– 1.59;P = 0.997）。另一方面,本研究还探讨了-1304T>G遗传变异与年龄、性别、吸烟、饮酒、癌症家族史、BMI对于肺癌风险可能的交互作用（或效应修饰作用）,发现-1304G变异基因型与BMI在降低中国南方人群患肺癌危险性上存在交互作用（P交互作用= 0.003）。为分析MKK4基因型与表型（基因表达）间的关系,进一步在30例肺癌组织中检测MKK4基因多态位点不同基因型对MKK4蛋白表达的影响,发现-1304G等位基因携带者的MKK4蛋白表达明显高于-1304TT基因型携带者（以β-actin作为内参以标化MKK4蛋白表达水平,-1304GG基因型MKK4蛋白表达水平为β-actin表达水平的0.78±0.09倍;-1304TG基因型为0.71±0.12倍;-1304TT基因型为0.50±0.26倍;方差检验:adjusted F = 4.728,P = 0.017）。且肺癌组织MKK4蛋白表达量与-1304G等位基因（allele）个数存在显著的剂量反应关系（线性趋势检验:P = 0.009）。对于多态性位点-1044A>T,本研究发现携带-1044AA基因型的肺癌组织（相对于β-actin表达水平的0.64±0.17倍）、携带-1044AT者（0.58±0.14倍）及携带-1044TT基因型者（0.56±0.16倍）间MKK4蛋白表达含量的差别无统计学意义（方差分析:adjusted F = 0.685,P = 0.513;线性趋势检验:P = 0.489）。为检测与肺癌发病有关联的MKK4基因多态-1304T>G对启动子转录活性的影响,本研究采用基因克隆技术构建两个包含MKK4基因启动子区域1612bp片段（相对于转录起始位点-1528—+84 bp）的报告基因质粒,两种质粒的区别仅在-1304多态位点分别为等位基因T（p1304T）或G（p1304G）;而在与人群肺癌无关联的-1044多态位点,两种质粒均为野生型等位基因A。将2种质粒分别转染16HBE、A549及L78等3种人肺细胞株,同时转染pGL3-basic质粒作为阴性对照,转染pRL-TK质粒作为内参,通过萤光素酶报告基因试验,检测MKK4基因多态性-1304T>G不同等位基因对启动子转录活性的影响。研究发现在上述3种肺细胞株中p1304G质粒的Luciferase活性比p1304T质粒分别增加了约2-3倍（在16HBE细胞株中,p1304G质粒的Luciferase活性增加了243%,P <0.001;在A549细胞株增加了301%,P <0.001;在L78细胞株增加了206%,P = 0.001）。三种细胞系的检测结果一致,都表明变异型等位基因-1304G比野生型等位基因-1304T的转录活性高。结合Western Blot试验的结果,提示MKK4基因-1304T>G多态确实为功能性遗传变异位点。本研究创新之处本研究首次证实了MKK4基因启动子遗传变异-1304T>G与中国南方人群肺癌的发病相关;首次发现MKK4基因启动子-1304多态位点T>G的置换明显增加了MKK4基因的转录水平;同时还发现研究对象体重指数可影响-1304G变异基因型与肺癌的关联,这也是在肺癌的分子流行病学研究中第一次发现该基因与BMI的交互作用。以上创新点填补了国内外相关研究的空白。本研究不足之处本研究仅限于中国南方人群,研究结论尚需在其他人群进一步验证。另本研究缺乏电泳迁移率阻滞试验（EMSA）及染色体免疫沉淀（CHIP）等生物学功能试验,故尚不能完全明确-1304T>G位点变异与肺癌易感性关联的机制。研究结论:本研究首次发现MKK4基因启动子多态位点-1304T>G变异是中国南方人群患肺癌的独立相关因素之一,-1304G变异基因型能显著降低南方人群患肺癌的危险性,且随-1304G等位基因个数增加呈现显著的剂量-反应关系。本研究还发现-1304G变异基因型的保护作用在低体重及体重正常者更为显著,而在超重和肥胖者受到抑制;该基因位点与BMI在降低肺癌发病风险方面存在交互作用。Western Blot试验和体外萤光报告基因试验结果提示MKK4基因的-1304G等位基因可通过增强MKK4基因转录活性,增加MKK4基因的表达,而降低肺癌发病风险。本研究结果提示可将MKK4基因的遗传变异-1304T>G作为人群肺癌易感性的生物标志。本研究结论需更大样本及更多种群的人群研究予以验证。