Fractalkine通过p38MAPK信号通路调控狼疮性肾炎Treg细胞凋亡的作用研究

来源 :右江民族医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:denggaoangyuan
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第一部分系统性红斑狼疮患者Fractalkine与调节性T细胞的相关性分析目的:通过检测系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)患者和健康对照者血清Fractalkine(FKN)的表达水平和外周血中调节性T细胞(Treg细胞)的分布,分析FKN和Treg细胞水平与SLE疾病活动性的相关性,初步探讨FKN与Treg细胞在SLE中的作用。方法:选取右江民族医学院附属医院初次诊断为SLE的31例患者和11例健康体检者,根据系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLE disease activity index,SLEDAI-2K)评分标准评估SLE患者的疾病活动性。并将所有研究对象分为三组:健康对照组、SLE非活动期组及SLE活动期组。用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组FKN的血清水平,用流式细胞术(Flow cytometry,FC)分析各组外周血中的Treg细胞数,比较各组之间的差异。采用SPSS23.0统计软件进行分析血清FKN及外周血Treg细胞与系统性红斑狼疮疾病活动度之间的相关性。结果:与健康对照组相比,SLE非活动组及活动组患者血清FKN表达水平显著升高,Treg细胞的分布则显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01);活动期SLE患者血清FKN表达水平明显高于非活动期SLE患者,Treg细胞数则明显低于非活动期SLE患者,差异均有统计学意义(P<0.01)。SLE患者FKN表达水平与SLEDAI-2K呈正相关,与Treg细胞的分布呈负相关。结论:SLE患者血清FKN表达增加伴随着Treg细胞下调,FKN参与了SLE的发病机制。第二部分狼疮性肾炎小鼠Fractalkine、p38MAPK的表达及Treg细胞的分布研究目的:检测狼疮性肾炎小鼠血清中Fractalkine、p38 Mitogen-activated Protein Kinase(p38MAPK)、Foxp3的表达水平及外周血中Treg细胞的分布,与正常小鼠比较,探讨Fractalkine、p38MAPK、Foxp3的表达水平及外周血中Treg分布的变化研究。方法:给予巴比西小鼠一次性腹腔注射0.5m Lpristane构建狼疮性肾炎小鼠模型,12周后检测模型小鼠的24小时尿蛋白含量、血清抗核抗体水平及PASM染色检测肾组织的变化以鉴定模型的成功构建。接着,将小鼠分为两组:正常组和模型组。通过流式细胞术分析小鼠外周血Treg细胞的分布,采用ELISA方法检测血清中Fractalkine、Foxp3的水平,免疫荧光染色(Immunofluorescence,IFC)、免疫蛋白印迹(Western-blot)和实时荧光定量聚合酶(Real-time PCR,q RT-PCR)方法检测肾组织中Fractalkine、p38MAPK及Foxp3的表达水平。结果:在小鼠腹腔注射pristane 12周后,与对照组相比,模型小鼠的24小时尿蛋白含量及血清抗核抗体水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01),肾脏组织病理结果显示模型组小鼠肾小球有不同程度的损伤,鉴定LN小鼠模型建立成功。与对照组相比,LN组的外周血Treg细胞的分布明显降低(P<0.01)。血清中Fractalkine的表达水平显著升高,Foxp3的表达水平显著降低(P<0.01)。肾组织中Fractalkine、磷酸化p38MAPK的表达水平明显升高,而Foxp3的表达水平显著降低(P<0.01)。非磷酸化p38MAPK的表达水平无明显改变(P>0.05)。结论:Fractalkine可能通过p38MAPK信号通路调控Treg细胞进而参与狼疮性肾炎的发病过程。第三部分Fractalkine通过p38MAPK信号通路调控狼疮性肾炎Treg细胞凋亡的作用研究目的:本课题研究的关键点为Fractalkine(FKN),从细胞水平上深入研究FKN在Treg细胞中的作用机制。通过观察体外实验狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)小鼠Treg细胞敲低FKN基因后,细胞中FKN、p38MAPK和Foxp3表达水平的变化,及U-46619、SB203580(U-46619为p38MAPK的激活剂,SB-203580为p38MAPK的抑制剂)对LN小鼠Treg细胞的具体作用机制,探讨p38MAPK信号通路在Treg细胞凋亡过程中的作用以及FKN对p38MAPK信号通路的具体影响机制,进一步了解FKN在Treg细胞中的作用机制,为狼疮性肾炎的诊治新靶点提供理论依据。方法:通过转染腺病毒载体particle-FKN实现FKN基因敲低的LN Treg细胞,将细胞随机分为7组:(1)正常对照组;(2)阴性对照组;(3)FKN-KD组;(4)U-46619组;(5)SB203580组;(6)FKN-KD+U-46619组;(7)FKN-KD+SB203580组。采用western blotting验证FKN敲低的成功转染;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;采用western blotting和q RT-PCR检测各组细胞的Foxp3、p38MAPK信号通路及细胞凋亡相关因子的表达水平变化。结果:敲低FKN后p38MAPK的磷酸化水平明显降低,而Foxp3表达明显增加(P<0.01)。U-46619促进p38MAPK的磷酸化(P<0.01),下调LN Treg细胞中Foxp3的表达((P<0.01));SB203580抑制p38MAPK的磷酸化(P<0.01),上调LN Treg细胞中Foxp3的表达((P<0.01);敲低FKN后,Bax、Cyt-c的表达水平显著下调(P<0.01),细胞凋亡率显著下调(P<0.01),Bcl-2的表达水平显著上调(P<0.01);U-46619干预后,与对照组相比,Bax、Cyt-c的表达水平显著上调(P<0.01),细胞凋亡率显著上调(P<0.01),Bcl-2的表达水平显著下调(P<0.01);SB203580干预后,与对照组相比,Bax、Cyt-c的表达水平显著下调,细胞凋亡率显著下调(P<0.01),Bcl-2的表达水平显著上调(P<0.01)。结论:FKN通过激活p38MAPK信号通路参与狼疮性肾炎Treg细胞凋亡的过程,这为阐明狼疮性肾炎的发病机制提供了实验依据。
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