研究背景N-myc下游调节基因2(NDRG2)，与其他NDRG2家族的蛋白存在约60%相似的氨基酸残基。NDRG2与细胞生长，分化，应激和激素的刺激反应存在密切联系.以往研究表明，NDRG2的表达可受到多种合成代谢和分解代谢激素调节，比如地塞米松,雄激素and醛固酮.尽管NDRG2在心脏中高表达，但它在心血管系统中的功能还广泛未知。我们在前期研究中发现，心肌缺血再灌注（I/R）损伤可改变心肌组织中NDRG2的表达。心血管事件例如急性心肌梗死是引起患者致残和致死的主因。冠状动脉发生梗塞后，临床现有的挽救存活心肌的主要措施包括冠脉血运的重建，即再灌注。但是，缺血组织的血运重建本身可引发心肌的再灌注损伤,不仅可以造成细胞死亡，还可以引起心肌组织功能性的损伤，反而降低了血运重建所带来的益处。因此，明确再灌注损伤的具体分子机制和寻找新的目标分子来缓解再灌注损伤已经成为研究的热点。很多文献对于胰岛素在缺血再灌注损伤中所起的心肌保护特性已有了较为详尽的报道。胰岛素可以通过激活一系列胞内蛋白激酶来保护心肌抵御缺血再灌注损伤，这些激酶被命名为再灌注损伤补救激酶(reperfusion injury salvage kinases:RISK)，包括PI3K-Akt, JAK-STAT和ERK系统的激活。但是，胰岛素发挥心肌保护作用的机制还没有被完全阐述清楚。NDRG2作为蛋白激酶Akt的底物之一，可以参与Akt介导的胰岛素信号传导通路。我们的前期研究表明，在Akt介导的胰岛素保护胰岛β细胞抵抗游离脂肪酸引发的损伤中，NDRG2发挥了重要作用。但是，NDRG2是否有可能在胰岛素心肌保护中发挥作用还未见文献报道。实验目的在本研究中，我们首先观察在心肌细胞和心肌组织在经受缺血再灌注损伤过程中，NDRG2总蛋白和磷酸化蛋白水平的表达情况，以及其受到胰岛素干预的调节情况和分子机制。在此基础上，进一步探讨在心肌缺血再灌注损伤过程中，NDRG2的磷酸化水平的变化是否参与了Akt所介导的胰岛素的心肌保护效应。材料和方法1．雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，体重在140-180g之间，建立大鼠心肌缺血再灌注模型。采用腹腔注射戊巴比妥钠溶液的方法麻醉大鼠,以体外量循环呼吸机保证术中动物呼吸。在大鼠左侧股动脉中置入一根预先充满肝素化生理盐水的PE-50导管来监测术中大鼠血压。大鼠心跳速率通过ECG来测量。在大鼠的左胸部位作一切口，暴露心脏，以6-0的丝线围绕冠状动脉左前降支（LAD）做一活结。缺血30分钟后，解开线结，恢复LAD血运。假手术组接受开胸等类似的的手术过程，除了阻断LAD这一步骤。2．在第一部分实验中，为了观察NDRG2的磷酸化水平在心肌组织中的变化情况，我们首先将大鼠随机分成以下几个组：假手术组，单纯缺血组(30min)，缺血30min后分别加1,2,3or4h的再灌注(n=5).在第二部分实验中，为了检测胰岛素对于Akt/NDRG2信号通路的效应,大鼠随机分组并接受以下处理：(1)假手术组;(2)安慰剂组(0.9%NaCl);(3)极化液GIK (葡萄糖:200g/L,胰岛素:60U/L,钾离子:60mEq/L)，从再灌注5min前开始静脉输注4h（4mL/kg/h）;(4)去胰岛素极化液GK (葡萄糖+钾离子)(n=16).术前用小动物超声监测大鼠心脏功能来建立基线标准。3．乳鼠原代心肌细胞的培养和体外模拟缺血／再灌注（SI/R）模型的建立；大鼠H9C2心肌细胞系和INS-1胰岛素瘤细胞系的培养。4． siRNA以及lenti-shRNA的合成与转染： siRNA的合成序列为：5-CCAAACGUCCAGCGAUAUUCATT-3。 siRNAs以Lipofectamine2000转染入细胞内。预实验结果显示，携带有GFP基因序列的对照慢病毒感染原代心肌细胞后，70–80%的细胞可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号。5．在体动物水平的病毒接种：在手术4天前，雄性SD大鼠以戊巴比妥钠麻醉后，经口气管插管后，体外呼吸机建立正压通气。在左侧胸部第四肋间作一切口暴露心脏。用微量注射器抽吸病毒后，分别分三个点注射到即将缺血心肌处。6．伊文氏蓝/TTC染色测定心肌梗死范围；TUNEL染色，免疫印迹法和流式细胞法检测心肌细胞凋亡；小动物心脏超声检测大鼠左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）；反转录PCR检测各基因mRNA表达水平；免疫印迹法检测各总蛋白和磷酸化蛋白水平。实验结果1．NDRG2的磷酸化水平在再灌注早期（1h）有轻度上升的趋势，但是其总蛋白水平无显著差异。随着时间的推移，NDRG2的磷酸化水平逐渐降低，并且在再灌注4h时达最低点。当原代培养的乳鼠心肌细胞在经受体外模拟的缺血再灌注应激下，我们也可以观察到类似的趋势，NDRG2的磷酸化水平大约在恢复氧供6h时达最低点。2．再灌注时期输注GK液（去胰岛素极化液）可以显著提高大鼠血糖浓度，但是再灌注4h末，GIK极化液输注组和溶剂对照组两组血糖水平无显著性差异。与溶剂组相比，GIK治疗组在再灌注4h末，血浆中胰岛素水平得到了显著提高。3．相比较GK治疗组和溶剂对照组，GIK治疗组的caspase3的活性形式表达水平显著降低。免疫组化结果显示，GIK治疗组损伤心肌局部的黄褐色蛋白显著减少，表明了caspase3的活性形式表达水平的降低。此外，TUNEL染色也显示相同的趋势。4．与GK治疗组和溶剂对照组相比，在再灌注24h后，胰岛素治疗组（GIK）心肌梗死区（INF）占危险区（AAR）百分比显著减小。此外，小动物超声检测大鼠的心功能显示胰岛素的使用可显著提高心脏左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVES），而其它两组在治疗后心功能相对于非治疗对照组无显著性差异。5．在缺血30min再灌4h后，胰岛素的使用可以显著的逆转在缺血再灌注NDRG2和Akt的下降趋势，NDRG2的磷酸化位点为Thr348，Akt的磷酸化位点为Ser473.而NDRG2和Akt的总蛋白水平在给予胰岛素干预后无显著变化。此外，当给予原代心肌细胞模拟缺血再灌注损伤刺激后，胰岛素的处理可以上调Akt在Ser473位点的磷酸化水平。胰岛素的这一作用可被PI3K的抑制剂Wortmannin所阻断。与此同时，胰岛素也可以上调NDRG2在Thr348位点的磷酸化水平，这一作用同样可以被Wortmannin以及Akt激酶特异性的抑制剂所阻断。6．相比较单用胰岛素，当胰岛素同Wortmannin或Akt抑制剂共同处理原代心肌细胞时，caspase3的活性形式的表达水平显著提高。同时，胰岛素同Wortmannin或Akt抑制剂共处理组的TUNEL阳性细胞也较单用胰岛素组显著增多。此外，我们还培养了大鼠胚胎来源的心肌细胞系H9C2细胞系并给予了相似的缺血再灌注处理。流式结果分析显示，相较于单用胰岛素组，胰岛素同Wortmannin或Akt抑制剂共处理组凋亡的细胞数量显著增多。7．对照siRNA处理后，INS-1细胞NDRG2的表达无显著变化。但是，NDRG2siRNA可以对INS-1细胞中NDRG2的表达产生影响，且呈浓度梯度依赖性。基于此siRNA序列的NDRG2shRNA的慢病毒颗粒感染心肌细胞三天后，细胞NDRG2的mRNA和蛋白水平均显著下调。8．尽管胰岛素的处理诱导了Akt的激活，但是NDRG2的总蛋白水平核在Thr348位点的磷酸化水平均受到了抑制，NDRG2干涉后的心肌细胞呈现出更高的caspase3活性形式的表达。同时，在用对照病毒颗粒感染INS-1细胞后，胰岛素处理可产生明显的保护作用。但是，在用携带特异性针对NDRG2的NDRG2shRNA病毒颗粒感染INS-1细胞后，即使用胰岛素处理，TUNEL染色也显示出显著升高的凋亡细胞比例。9．慢病毒颗粒局部注射24h后，免疫荧光染色结果显示，对比非注射区，注射区心肌局部CD11b呈阳性的细胞数量部分增多。在针对NDRG2的慢病毒颗粒注射96h后，NDRG2在注射区域局部心肌组织的mRNA和蛋白水平均显著下降；而使用Scramble病毒后，相比对照组，注射区域NDRG2的蛋白水平无显著差异。免疫组化染色结果也提示，注射区域，即在手术中将受到缺血的区域，NDRG2表达在三个不同的位点均得到显著降低。但是，远离注射区域，比如室间隔和右室，心肌的NDRG2水平无显著下调。此外，慢病毒颗粒的注射没有诱导远离注射区域心肌NDRG2总蛋白和磷酸化水平的变化。10．当以GIK极化液治疗后，相比较Scramble病毒处理组，NDRG2干涉慢病毒处理组心肌组织的活性caspase3表达水平比Scramble病毒处理组心肌显著提高；心肌组织中绿色TUNEL阳性细胞比例显著提高。此外，EB/TTC染色显示，相比较Scramble病毒处理组，NDRG2干涉慢病毒处理组大鼠心肌梗死区域占危险区百分比（INF/AAR）显著提高。小动物心脏超声结果也提示，NDRG2干涉慢病毒处理组的大鼠左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）均较Scramble病毒处理组显著降低。11．给予NDRG2干涉慢病毒处理后，邻近区域心肌的NDRG2水平相比较远离区域无显著降低。TUNEL染色也显示，GIK治疗后，NDRG2干涉慢病毒处理组和Scramble病毒处理组的邻近区域的凋亡率无显著差异。结论我们在这项研究中主要对在心肌缺血再灌注损伤损伤，NDRG2的磷酸化形式在胰岛素发挥心肌保护效应过程中所扮演的角色进行了探讨，主要发现包括以下几点：第一，在心肌缺血再灌注过程中，NDRG2磷酸化水平呈下降趋势，有可能与Akt的磷酸化水平的变化相关。第二：再灌过程中的胰岛素治疗可以依赖PI3K/Akt途径显著提高NDRG2的磷酸化水平。第三，即使在有胰岛素处理情况下，NDRG2的干预可加剧体外培养的原代心肌细胞的凋亡。第四也是最重要的一点，在动物水平的实验中，人为的下调NDRG2的表达可显著减弱胰岛素治疗所带来的心肌保护作用。这些结果均表明，在心肌缺血再灌注损伤过程中，NDRG2可能作为一个新的信号通路分子参与胰岛素的心肌保护。