背景、目的最近的研究表明,肿瘤组织中存在着一小部分表达特异表面标志的肿瘤细胞,它具有不断的自我更新能力和一定的分化潜能,在动物移植瘤实验中它具有极强的致瘤性,因此被称为肿瘤干细胞。研究发现它所具有的自我更新和未分化的特性是受肿瘤间质细胞、血管内皮细胞等微环境的维持和调控的,同时它高表达耐药蛋白,具有极强的DNA损伤后修复功能,因而具备耐药和放射抵抗性。因此,肿瘤干细胞是肿瘤始动的根基,是肿瘤转移、复发和耐药的根源。目前已在白血病和乳腺癌、脑肿瘤、胰腺癌、大肠癌等多种实体肿瘤中发现肿瘤干细胞的存在。而肿瘤细胞系作为研究肿瘤的经典模型,自Toru Kondo等发现多种已建系的肿瘤细胞系中存在少量的肿瘤干细胞后,细胞系中肿瘤干细胞的研究有一定进展,但大多局限在胶质瘤、乳腺癌等细胞系。国内朱玉德等发现,人脑胶质瘤细胞能在含生长因子的无血清培养基中形成细胞球,这种细胞球富集了肿瘤干细胞,因而称之为脑肿瘤干细胞球。目前为止,研究大肠癌细胞系中肿瘤干细胞的报道不多。因此,本实验选取一株人大肠癌Colo205细胞系,试图研究特殊培养条件下大肠癌Colo205细胞如何生成大肠癌干细胞球,并对大肠癌干细胞球进行鉴定和生物学特性研究,以期为进一步研究靶向杀伤大肠癌干细胞的研究奠定基础。大肠癌Colo205细胞是Toni U.Semple于1975年建系,原标本来自于一名70岁白人的大肠癌腹水转移瘤细胞,在常规培养基中具有悬浮和贴壁生长的混合型生长特性。方法:1、大肠癌干细胞球的培养无血清DMEM/F12培养基(serum-freemedium,SFM),包含B27、EGF、bFGF、LIF和L-谷氨酰胺等,培养大肠癌Co1o205细胞,以含10%胎牛血清的1640培养基(serum-supplemented medium,SSM)培养的普通Colo205细胞为对照组,观察Colo205细胞在无血清培养基中形成大肠癌干细胞球的过程,对形成的大肠癌干细胞球进行肠道干细胞标志Musashi-1的细胞免疫荧光鉴定。2、诱导分化实验将在无血清培养基中形成的大肠癌干细胞球重新置于含血清培养基中诱导其分化,倒置显微镜观察细胞形态变化。收集大肠癌干细胞球、大肠癌干细胞球分化后细胞和普通Colo205细胞,进行Anti-CD44-FITC和Anti-CD133-PE标记,流式细胞法检测各组CD133～+、CD44～+、CD133～+CD44～+细胞的比例。3、细胞周期实验收集大肠癌干细胞球和普通Colo205细胞,调整为相同细胞浓度后进行PI标记,流式细胞法检测各细胞周期比例。4、核型分析收集大肠癌干细胞球和普通Colo205细胞,调整为相同细胞浓度后进行核型分析,平均每例分析中期分裂相10个,对染色体条数进行统计学分析。5、三维培养无血清培养的Colo205细胞形成典型的大肠癌干细胞球的时候,给予胰酶消化和机械吹打成单细胞悬液,置于含血清常规培养基中,调整细胞浓度为60000个/ml备用,对照组为相同浓度的常规含血清培养基中培养的Colo205细胞,置于Matrigel胶中做三维培养,观察其分化成“隐窝样”结构。6、RT-PCR检测干性基因分别提取大肠癌干细胞球和普通Colo205细胞的RNA,经过逆转录成eDNA后,再经过PCR扩增,半定量检测“干性基因”Bmi-1和Notch-1表达量。7、大肠癌干细胞球的免疫缺陷鼠皮下移植实验设定多个浓度梯度,比较相同浓度下大肠癌干细胞球和普通Col0205细胞的成瘤能力,并对所形成的瘤体进行透射电镜观察、HE染色和Musashi-1的免疫组化分析。8、统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行数据分析,实验结果用均数±标准差表示,细胞周期分析、RT-PCR分析、“隐窝样”结构计数、干性基因灰度比值以及染色体条数等比较采用两独立样本t检验,表面标志的比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法,P<O.05被认为有显著性差异。结果:1、Colo205细胞接种于含生长因子的无血清培养基中,培养第7天时,大部分贴壁细胞崩解凋亡,而一小部分细胞能持续扩增形成悬浮的大肠癌干细胞球。该大肠癌干细胞球可多次传代,体现了不断自我更新的性能。在无血清培养基中的大肠癌干细胞球重新置于含血清培养基中,可见细胞球内细胞逐渐移行出细胞球,培养10 d后形成贴壁的单细胞层。对细胞进行Mushashi-1荧光鉴定,发现大肠癌干细胞球高表达肠道干细胞标志Musashi-1,而在无血清培养的普通Colo205细胞不表达Musashi-1。2、普通Colo205细胞CD133～+、CD44～+、CD133～+CD44～+细胞的比例分别为(13.27±5.62)%,(62.92±8.38)%,(10.77±4.96)%,而大肠癌干细胞球三个指标的比例分别为(52.71±16.97)%,(79.06±12.10)%,(46.89±19.17)%,大肠癌干细胞球分化后三个指标的比例分别为(16.47±2.45)%,(46.89±19.17)%,,(12.41±2.27)%,不同组间各阳性细胞比例有差异,F值分别为17.517、10.752、12.294,P值分别为0.001、0.003、0.002,其中大肠癌干细胞球CD133～+、CD44～+、CD～133+CD44～+细胞比例均高于大肠癌干细胞球分化后和普通Colo205细胞组,差异有统计学意义(P<O.05),大肠癌干细胞球分化后与普通Colo205细胞组相比差异无统计学意义(P>O.05)。3、细胞周期的检测普通Colo205细胞G1期为(73.8±2.9)%,S/G2期为(26.2±2.9)%,大肠癌干细胞球G1期为(51.9±1.6)%,S/G2期为(48.1±1.6)%,大肠癌干细胞球S/G2期比例与普通Col0205细胞相比,差异有显著性(P=0.000),表明大肠癌干细胞球处于高增殖状态。4、对大肠癌干细胞球与普通Col0205细胞进行核型分析比较,发现两组细胞均为非整倍体,两组细胞染色体条数无显著性差异(P=0.070)5、大肠癌干细胞球在第18天时形成典型的“隐窝样”结构,细胞互相连接成环状结构,且有向上重叠生长的趋势,而对照组未见任何“隐窝样”结构形成,细胞老化停止增殖。说明大肠癌干细胞球组具有很强的增殖和分化潜能,而普通Co1o205细胞仅有有限的增殖能力,无分化潜能。培养第18天时,计数“隐窝”样结构。普通Colo205组隐窝个数为0,而大肠癌干细胞球组个数为8.6±1.1个,95%的可信区间为[7.184,10.016],不包含0,可见大肠癌干细胞球在三维培养中生成隐窝个数高于普通Colo205细胞。6、RT-PCR半定量分析发现大肠癌干细胞球组Bmi-1和Notch-1表达水平较普通对照组增高(P值分别为0.002和0.031),差异有显著性。表明大肠癌干细胞球具有很强的自我更新的能力。7、动物移植瘤表明,104个大肠癌干细胞球细胞即能生成肿瘤,而相同数目的普通Colo205细胞则不能,105个大肠癌干细胞球细胞致瘤后的体积明显较对照组大,说明了大肠癌干细胞球的高致瘤性。成瘤4周后的瘤体进行HE常规染色发现两者分化结构类似,肠道干细胞标志Musashi-1染色也说明阳性细胞在两种移植瘤均有相似的表达量,透视电镜发现两种移植瘤细胞均具有高度恶性。说明大肠癌干细胞是启动小鼠肿瘤生长的根基,它在小鼠体内启动肿瘤生长的同时,也在间质细胞和细胞因子等微环境作用下,最终成瘤时的分化结构、分化程度和恶性程度达到一致,表明它具有不断自我更新和一定的分化的能力。结论:1、Colo205细胞中存在少量的大肠癌干细胞。含生长因子的无血清培养基培养Co1o205细胞,可生成大肠癌干细胞球,这种细胞球富集了大肠癌干细胞。2、大肠癌干细胞球高表达肿瘤干细胞标志CD133、CD44,加入血清诱导分化后肿瘤干细胞标志表达量明显降低,其中CD44为本课题组在国内外首先发现并鉴定。3、大肠癌干细胞球在体外具有不断自我更新和一定的分化潜能,高表达干性基因Bmi-1和Notch-1,在三维培养中能分化成“隐窝样”结构。4、大肠癌干细胞球在免疫缺陷鼠的成瘤能力明显强于普通Colo205细胞,说明所培养的大肠癌干细胞球具有肿瘤干细胞的特性。