鱼类为适应复杂的水体环境进化出一套独特的黏膜免疫系统,其不仅可以作为物理屏障,非特异性抵御病原的入侵,还可以通过产生抗体发挥特异性免疫防御的功能。合适的病原感染模型是研究鱼类黏膜免疫系统的重要工具,刺激隐核虫作为一种危害严重的海水鱼类寄生虫,主要寄生于海水硬骨鱼类皮肤、鳍条和鳃等体表黏膜组织,并可引起鱼类产生特异性免疫应答。因其独特的寄生特点,刺激隐核虫可作为研究鱼类黏膜免疫应答的良好病原模型。因此,开展鱼类抗刺激隐核虫感染黏膜免疫应答的研究,不仅可以揭示鱼类抗刺激隐核虫感染的免疫机制,也可为开发针对该寄生虫病的免疫防控技术提供理论依据。本研究首先制备了鼠抗石斑鱼IgM多克隆抗体,其可特异性识别石斑鱼血清和黏液中的IgM,同时也可以标记细胞;以此抗体分选的细胞具有淋巴细胞的形态,且表达鱼类IgM阳性B细胞特征性分子标记（IgM、Ig D和MHC II）。石斑鱼血清中的IgM主要为四聚体,同时也存在少量二聚体,而黏液中的IgM主要为四聚体。糖基化分析显示石斑鱼IgM重链可发生糖基化。石斑鱼IgM在各组织中表达丰富,其中头肾、脾脏、幽门盲囊及肠道等组织的抗体分泌能力较强,免疫组化也在这些组织中检测到了IgM阳性细胞。此外,还发现头肾白细胞中12.78±0.33%IgM阳性细胞具有吞噬大颗粒的活性。为研究石斑鱼IgM在抗刺激隐核虫感染免疫中的作用,我们首先构建了刺激隐核虫体表感染石斑鱼免疫模型:经三次免疫后,石斑鱼可抵抗约90%的刺激隐核虫再次感染。经刺激隐核虫免疫后,石斑鱼血清及黏液中的特异性及总IgM水平均显著上升,组织块体外培养试验显示这些IgM可由头肾和皮肤中的抗体分泌细胞进行分泌,且鳃中的IgM抗体分泌细胞在首次感染组及免疫组均显著上升;另外,被动免疫试验证实石斑鱼抗刺激隐核虫特异性IgM可由血液转运至皮肤黏液,暗示系统免疫组织产生的特异性IgM抗体也可转运至黏膜免疫组织参加应答;通过体外和体内的试验均证实IgM可与刺激隐核虫发生特异性结合;对免疫组石斑鱼的IgM进行RNA干扰后,可观察到刺激隐核虫的感染率显著上升,说明IgM参与刺激隐核虫的抗虫免疫。此外,使用重组刺激隐核虫GDCI3蛋白对石斑鱼进行注射免疫,在其血清和黏液中均发现有特异性IgM的产生,说明通过注射的方式同样可以引起石斑鱼黏膜抗虫免疫应答。为研究鱼类如何通过IgM启动宿主抗虫免疫应答,我们初步开展了石斑鱼BCR信号通路的研究。用鼠抗石斑鱼IgM的抗体刺激后,石斑鱼HKL的钙通量上升,提示石斑鱼具有完整的BCR信号通路;克隆了BCR信号通路6个关键基因,并分析了各基因的组织分布、亚细胞定位、NF-κB的激活等基本信息,发现刺激隐核虫感染可引起BCR信号通路的转录表达差异,推测BCR信号通路在感染后发生激活。制备了BCR信号通路其中一个关键基因——BTK的多克隆抗体,发现钒酸钠/过氧化氢处理可诱导HKL细胞中BTK蛋白发生磷酸化,而Ibrutinib处理则可抑制BTK磷酸化。此外,刺激隐核虫感染可引起鳃和皮肤中的BTK发生磷酸化,说明BTK在刺激隐核虫感染过程中被激活。