植酸酶(phytase)能够催化植酸及其盐类水解生成肌醇和无机磷酸(盐),在畜禽养殖业中被广泛用作饲料添加剂,以提高畜禽(主要为单胃动物)对饲料中磷源的有效吸收和利用,节省不可再生无机磷资源的过度消耗,减轻畜禽粪磷对环境的污染等。目前饲用重组植酸酶的获得主要利用大肠杆菌和酵母发酵系统等来生产,并已成功进入了产业化应用。　　 家蚕是著名经济昆虫,自驯化至今主要被用于取丝织绸。随着现代生物科技的发展,家蚕又以其强大的蛋白质合成能力和独特优势,在生物反应器领域备受青睐。家蚕脂肪体具有高效的蛋白质合成能力,尤其在五龄中后期至化蛹这段时间内,其脂肪体非常发达,约占体重的30%。如果按一头蚕(五龄盛食期)平均体重为5g计算,其脂肪体蛋白含量最高可达1.5g左右,如利用其生产外源蛋白,有望成为继丝腺之后又一具重大开发潜力的新型昆虫生物反应器。　　 前期研究中,我们克隆了家蚕30K蛋白家族成员BmLP3基因的启动子元件,并于个体水平证实其能够驱动外源基因在脂肪体中的特异高表达。在此基础上,本研究以具有高酶活特性的phyA基因为靶标,构建由BmLP3启动子驱动的piggyBae转座表达载体,经显微注射获得phyA转基因蚕,并分别进行分子检测及酶活测定,以探索利用转基因家蚕脂肪体生产重组植酸酶等功能性外源蛋白的可行性。获得的主要结果如下:　　 1,phyA基因的亚克隆和表达载体构建　　 以来源于黑曲霉的植酸酶基因序列(NCBIAccession:No.P34752)为基础,根据家蚕密码子进行优化后直接合成新基因phyA。以合成的质粒DNA为模板进行PCR扩增,克隆到pSL[BmLP3-DsRed-SV40]的质粒载体中,得到pSL[BmLP3-phyA-SV40];将phyA表达盒克隆至piggyBac基础载体pBac[3xp3-DsRed],构建成以脂肪体BmLP3启动子驱动的转基因表达载体pBac[3xp3-DsRed,BmLP3-phyA-SV40]。　　 2,植酸酶转基因蚕的获得　　 将pBac[3xp3-DsRed,BmLP3-phyA-SV40]载体质粒与辅助质粒pHA3PIG按摩尔比1:1混合至浓度为400ng/μL,注射家蚕实用品种“两广2号”母种“7532”早期胚胎,在G1代胚胎期第5-7天置于荧光显微镜下进行荧光筛选。从注射了BmLP3-phyA的8个蛾圈中筛选得到含阳性个体的蛾圈2个,阳性蛾圈率为25%,选择一个蛾圈饲育并进行后续分析和检测。　　 3,转基因蚕的分子检测　　 提取BmLP3-phyA转基因系G2代蚕蛾基因组DNA,分别进行Southern杂交和反向PCR检测。结果显示:该转基因系有目的基因插入且为单拷贝,转基因插入位点位于第14号染色体。提取BmLP3-phyA转基因系G2代组织的RNA,反转录成cDNA后进行qPCR检测显示,phyA基因在脂肪体中高量转录表达,且与内源BmLP3的表达模式基本一致,上蔟前后表达量达到最高。　　 4,rphyA抗体制备和蛋白检测　　 将原核表达的rphyA蛋白经镍柱纯化、切胶回收和透析超滤后,获得单一的蛋白,通过免疫家兔的方式制备了phyA基因多克隆抗体。利用SDS-PAGE和Westernblotting检测转基因家蚕脂肪体中rphyA蛋白的表达情况,结果显示:未经纯化的样品在SDS-PAGE和Westernblotting中均难以看到明显的信号,经镍柱纯化后的样品则可检测到rphyA杂交信号。　　 5,rphyA活性测定　　 取化蛹后2天的转基因蚕脂肪体总蛋白,采用国标法(GB/T18634-2009)测定rphyA活性,结果表明:在转基因家蚕脂肪体中表达的rphyA具有显著的酶活性,55℃时酶活达到99.05U/g,对植酸酶的性质进行检测显示,该重组植酸酶最适温度为55℃,有两个最适pH范围,分别为1.5-2.0和5.5-6.0。本研究初步证实了利用家蚕脂肪体作为生物反应器生产重组植酸酶等高附加值外源蛋白的可行性。