论文部分内容阅读
目的:探讨胰岛素对结肠肿瘤形成及其对结肠癌细胞自噬的影响,并初步探讨其机制。方法:(1)细胞部分:人结肠癌细胞(SW620)置于六孔板中培养(高糖DMEM培养基,内含10%胎牛血清,1%双抗),分为五组,A组(对照组,低糖培养基)、B组(自噬激活组,低糖培养基+雷帕霉素)、C组(低剂量胰岛素组,低糖培养基+雷帕霉素+低剂量胰岛素)、D组(高剂量胰岛素组,低糖培养基+雷帕霉素+高剂量胰岛素)、E组(胰岛素阻断组,低糖培养基+雷帕霉素+高剂量胰岛素+PI3K抑制剂LY294002)。培养至细胞生长数目达到80%左右,除对照组外均加入100nM雷帕霉素,6小时后,C组(低剂量胰岛素组)内加入普通胰岛素注射液使胰岛素浓度为10ug/ml,D组(高剂量胰岛素组)内加入普通胰岛素注射液使胰岛素浓度为100ug/ml,E组(胰岛素阻断组)内加入普通胰岛素(浓度为100ug/ml),同时加入PI3K抑制剂LY294002(100nM)阻断胰岛素。处理12小时后,C、D、E组内再次胰岛素处理一次,12小时后提取各组细胞蛋白样品,通过WB检测自噬相关蛋白的表达情况。(2)动物部分:4-6周龄雄性BALB/C裸鼠,随机均分为4组:普通对照组(A);低剂量胰岛素组(B);高剂量胰岛素组(C);胰岛素缺乏组/T1DM模型组(D)。适应性喂养1周后,先对D组进行一次性腹腔注射(Intraperitoneal injection,ip)链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(75 mg/kg)建立胰岛素缺乏的T1DM模型,其余各组注射同等剂量生理盐水。STZ连续注射一周后,通过尾静脉采血的方法测空腹血糖值,若测值大于16.7 mmol/L,认为胰岛素缺乏的T1DM模型成功建立。D组建模成功后,即开始对四组裸鼠同时于左侧前肢腋下皮下注射结肠癌细胞(细胞数约1×10~7/只,加入0.2ml DMEM中)。同时开始每天分别对B组和C组皮下注射低剂量和高剂量中效胰岛素注射液(甘精胰岛素)(B组按0.25IU/kg,C组按0.5IU/kg,ih),A组和D组皮下注射同等剂量生理盐水。6周后取裸鼠肿瘤组织,分别通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察结肠癌组织结构,免疫组化检测自噬相关基因(LC3、GABARAPL1)的表达;透射电镜检测结肠癌组织内自噬泡的数量;Western blotting法检测自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、GABARAPL1)的表达。结果:1.细胞部分:胰岛素对自噬相关蛋白的表达有下调作用;2.动物部分:(1)透射电镜下观察各组结肠癌细胞内自噬性囊泡数目的改变:在高、低剂量胰岛素组观察到肿瘤组织内自噬小体数目较其他组减少。(2)免疫组化结果示:高、低剂量胰岛素组中自噬相关蛋白表达减弱。(3)WB检测结果示:高、低剂量胰岛素组中自噬相关蛋白表达减弱。结论:1.胰岛素对结肠癌细胞内的自噬活动有一定的抑制作用。2.胰岛素对自噬的抑制作用可能与下调GABARAPL1表达有关。