手足口病(hand-foot-and-mouthdisease，HFMD)是一种婴幼儿中常见的的传染病，世界上很多国家均有报道，尤其是近几年来在亚太地区广泛流行，已成为重要的公共卫生问题，引起了世界各国卫生组织的高度关注和警惕。手足口病由肠道病毒感染引起，可以引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），其中以肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CoxsackievirusA16，CA16)最为常见。目前尚没有针对手足口病的治疗性药物或预防性疫苗。　　本研究围绕着研发有效广谱的手足口病疫苗这一核心，开展了三部分研究工作，包括:(1)设计一种针对EV71的新型DNA疫苗，并在小鼠模型中评价该疫苗的免疫原性和保护效果;(2)制备针对CA16的灭活全病毒疫苗，并在小鼠模型中评价该疫苗主动免疫所产生的免疫效应和抗病毒攻击能力;(3)用EV71和CA16的灭活全病毒疫苗单独或共同免疫小鼠，比较单免组和共免组抗血清的中和抗体效价和广谱性，及其在体内的抗病毒保护效果。　　在第一部分工作中，我们分别构建了表达EV71全长编码序列(Codingsequence)和衣壳蛋白VP1基因的DNA疫苗，分别命名为pEVCDS和pEVVP1。体外的细胞转染实验表明，两种DNA疫苗均可正确表达目的蛋白。用两种DNA疫苗免疫小鼠后分析其体液和细胞免疫反应，通过ELISA判定免疫血清中均产生EV71VP1特异性抗体，同时，通过ELISPOT检测到脾脏中存在响应EV71VP1刺激的分泌IFN-γ的T细胞;另外，pEVCDS免疫血清中还检测到针对VP0和3C蛋白的抗体。体外中和实验结果显示，pEVCDS免疫血清的中和效价显著高于pEVVP1组的。在抗血清被动免疫-病毒攻击实验中，对照血清处理组的小鼠存活率为60％，而pEVCDS和pEVVP1抗血清组的小鼠存活率分别为100％和93％的存活率，表明中和性抗血清可以有效地保护小鼠免于致死剂量的病毒感染。　　在第二部分工作中，我们首先制备和鉴定了基于CA16灭活全病毒的实验性疫苗，该疫苗的主要蛋白成分为衣壳亚基蛋白VP1、VP0、VP3和VP2。用该疫苗间隔一周免疫小鼠两次，在第二次免疫后一周检测小鼠血清和脾脏细胞发现小鼠产生了CA16特异性抗体反应。并且在体外中和实验中证实了这些血清中的CA16特异性抗体对CA16病毒具有中和能力。在抗血清被动免疫-病毒攻击实验中，对照组Vetolysate和Untreated血清处理的小鼠存活率分别为23.1％和21.4％，而CA16灭活全病毒抗血清组的小鼠存活率为93.2％和85.9％。在随后进行的主动免疫保护实验中，我们对1日龄ICR乳鼠直接使用这种病毒灭活全病毒疫苗进行免疫接种，再使用CA16-MAV病毒对2免后7天的小鼠进行攻毒。CA16灭活全病毒疫苗100％保护了小鼠，与对照组86.9％到78.6％的死亡率形成了显著的差异。实验结果表明CA16灭活全病毒疫苗可以有效地保护小鼠免于致死剂量的病毒感染。　　在第三部分的工作中，我们增加了EV71这一重要致病源，采用与CA16单价灭活全病毒疫苗同样的制备纯化、免疫接种和动物评价方式，开展了手足口病双价病毒灭活全病毒疫苗的研究工作。用该双价灭活全病毒疫苗间隔两周免疫小鼠两次，在第二次免疫后两周检测了小鼠血清和脾脏细胞。实验结果显示，双价病毒灭活全病毒疫苗免疫可以同时引起针对EV71和CA16的特异性免疫反应。在中和实验中，这些特异性抗体具有的同时针对EV71和CA16病毒的中和能力，在血清被稀释1024倍的时候，仍可以100％保护细胞不受EV71或CA16病毒感染。在母源抗体保护实验中，双价病毒灭活全病毒疫苗保护组的乳鼠与Na(i)ve组一样，自始至终未发现明显的临床症状。实验结果表明手足口病双价灭活全病毒疫苗可以有效地保护小鼠免于致死剂量的EV71或CA16病毒感染。　　通过以上工作，我们得出结论:　　(1)表达EV71全长CDS的DNA疫苗与只表达EV71衣壳蛋白VP1的DNA疫苗相比，能够诱导更全面的免疫反应从而获得更好的保护效果。　　(2)CA16单价灭活全病毒疫苗主动免疫可以诱导CA16特异性中和抗体产生，这些抗体能够保护小鼠免于致死剂量的CA16病毒感染。　　(3)EV71和CA16病毒灭活全病毒疫苗共同免疫能够协同地诱导针对这两种病毒的中和抗体，在体内能够抵抗两种病毒的攻击，因此，基于双价灭活病毒的广谱手足口病疫苗策略是可行的。　　以上研究结果为进一步开发安全有效的手足口病疫苗奠定了基础。