【摘 要】
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甲基对硫磷不可逆的抑制乙酰胆碱酯酶的活性,导致乙酰胆碱的堆积,从而引起随后的神经功能丧失和最终死亡,因此常被用作杀虫剂而广泛应用,但是使用过程中也容易造成环境污染。有机磷水解酶是一类可以破坏有机磷分子的磷酯键,最终使有机磷化合物毒性消失的酶。本研究构建了来源不同的有机磷水解酶（来源Pseudomonas pseudoalcaligenes的oph基因以及来源于邻单胞菌属中Plesiomonas s
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甲基对硫磷不可逆的抑制乙酰胆碱酯酶的活性,导致乙酰胆碱的堆积,从而引起随后的神经功能丧失和最终死亡,因此常被用作杀虫剂而广泛应用,但是使用过程中也容易造成环境污染。有机磷水解酶是一类可以破坏有机磷分子的磷酯键,最终使有机磷化合物毒性消失的酶。本研究构建了来源不同的有机磷水解酶（来源Pseudomonas pseudoalcaligenes的oph基因以及来源于邻单胞菌属中Plesiomonas sp.M6菌株的mph基因）在Pichia pastoris GS115表面的两种展示方式。首先成功构建了P.pastoris GS115直接表面展示型表达载体p PICZαA-HA-mph-SED1、p PICZαA-HA-oph-SED1、大肠杆菌表达载体p ET23a-CL7-mph、p ET23a-CL7-oph;然后将上述测序正确的P.pastoris GS115重组载体线性化后转化GS115菌株,并使用含zeocin抗性的YPD平板筛选活性较高菌株进行摇瓶表达;同时将测序正确的质粒p ET23a-CL7-mph、p ET23a-CL7-oph分别转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）,纯化融合蛋白CL7-MPH和CL7-OPH后分别将其结合到菌株P.pastoris GS115/p PICZαA-HA-IM7-SED1上构成间接表面展示菌株。使用流式细胞和免疫荧光显微镜技术检测直接与间接表面展示方式的效率,结果显示两种方式均成功将MPH和OPH锚定于细胞表面,且直接与间接展示效率分别为81.17%、57.44%;81.12%、70.07%。将直接与间接表面展示菌株分别进行全细胞活性测定,结果显示直接展示蛋白HMS、HOS的最适作用温度分别为20℃和50℃,最适作用pH分别为10、11;间接展示蛋白HIS-CM、HIS-CO的最适作用温度分别为40℃和50℃,最适作用pH分别为8、9;5 mmo L/L重金属离子对直接表面展示菌株HMS、HOS和间接表面展示菌株HIS-CM的酶活抑制作用不大,并且有一定的促进作用;但对HIS-CO的酶活抑制作用稍大;底物浓度为50 mmol/L时,HMS和HOS的比酶活分别为10.95 U/mg、13.66 U/mg,HIS-CM和HIS-CO的比酶活分别为6.57 U/mg、6.51 U/mg,HOS的酶活与已知有机磷水解酶展示在酿酒酵母表面的最大酶活18.2 U/mg相差4.54U/mg。通过酶学性质研究发现直接表面展示有机磷水解酶具有较广的pH和温度范围以及不被金属离子抑制甚至能被某些金属离子激活的特性,表明该酶适合在条件比较复杂的环境中工作,扩大了其应用范围。本研究成功利用酿酒酵母细胞壁蛋白SED1将MPH和OPH展示在P.pastoris GS115表面,构建表面展示有机磷水解酶的P.pastoris GS115工程菌株;同时利用CL7/Im7强相互作用对将有机磷水解酶间接展示于P.pastoris GS115表面。本研究的两种P.pastoris GS115展示方法均能有效用于对甲基对硫磷的生物降解酶系中,同时为其他难以表达纯化的蛋白提供了行之有效的表达方法,也为后续有机磷水解酶在细胞表面展示等方面的研究提供参考,进而丰富了对有机磷水解酶研究的成果,最后也为其它酶在P.pastoris GS115细胞展示提供方法及依据。
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