拟南芥乙烯合成因子依赖ROS代谢调节盐胁迫反应

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植物激素乙烯不仅能够调节植物的生长发育,而且能够调节植物对于逆境的应答反应。乙烯合成的前提物质是1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-Amin-ocyclopropane-1-Carboxylic Acid,ACC),ACC合酶(ACC Synthase,ACS)催化SAM(S-adomet)转变为ACC,这一反应是乙烯生物合成的限速步骤。模式植物拟南芥ACS基因家族共有12个,其中9个基因编码不同的ACS同工酶。研究显示,这些ACS同工酶调节拟南芥生长发育及对逆境的应答。本论文选择拟南芥ACS基因家族中比较活跃的、且依赖活性氧(ROS-dependent Ethylene Biosynthesis factor,REB)的2个基因,将其命名为AtREBA和AtREBB。进行一系列的实验:以拟南芥T-DNA插入失活纯合突变体atreba、atrebb以及atreba/b双突变体(3个株系突变体均购自美国拟南芥资源中心ABRC)为材料,NaCl处理表型鉴定显示,对照实验中3个株系突变体萌发与野生型并无明显差别;在150mmol/L NaCl盐处理下,3个株系突变体的萌发率明显低于野生型,其中atreba、atrebb、atreba/b萌发率分别下降了52%、92%,、80%;且植株长势明显差于野生型。推测AtREBA和AtREBB缺失可能影响植株应对盐胁迫。半定量RT-PCR结果显示,AtREBA和AtREBB之间一个基因缺失不影响另外一个基因表达。推测在转录水平2个因子没有互作。GUS染色结果显示,150mmol/L NaCl处理下,AtREBA和AtREBB表达量有不同程度升高。可知盐胁迫影响两基因表达。酵母双杂交实验显示,AtREBA和AtREBB两个基因在体外会发生相互作用。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)实验显示,两个基因在植物体内存在相互作用,作用位置主要在原生质体质膜上。同时150mmol/L NaCl处理下,650s内相互作用程度会增大10倍。由此可知,蛋白水平上AtREBA和AtREBB相互作用,盐胁迫刺激二者互作程度增大;与半定量RT-PCR结果一致。盐胁迫引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)在植株体内产生和积累。检测atreba、atrebb、atreba/b植株中H2O2产生和积累情况发现:150mmol/L NaCl处理下,利用DAB对野生型和3个株系突变体染色,与对照组植株相比,处理后植株叶片中H2O2积累量有不同程度的升高。利用H2O2探针标记并检测植株体内H2O2含量,与DAB染色结果一致:150mmol/L NaCl处理下,野生型、atreba、atrebb、atreba/b植株根部荧光亮度分别升高了18.37%、64.34%、58.09%和51.35%。检测ROS产生酶--NADPH氧化酶的关键基因AtRBOHD和AtRBOHF表达情况,转染AtRBOHD和AtRBOHF的GUS载体,与野生型及atreba中,染色结果发现AtREBA缺失会明显影响AtRBOHD和AtRBOHF在植株中的表达。ROS代谢与其清除酶活性有关,过氧化氢酶(catalase,CAT)能专一性清除ROS家族的H2O2。150mmol/L NaCl处理下,野生型、atreba、atrebb、atreba/b中CAT活性分别降低了19.01%、58.33%、25.26%、44.76%,这说明AtREBA和AtREBB对植株CAT活性具有调节作用,而在盐胁迫下,这一作用尤其明显。由此可知,AtREBA和AtREBB在盐胁迫下影响植株体内ROS代谢,从而影响植物对于盐胁迫反应。综上所述,盐胁迫条件下,拟南芥AtREBA和AtREBB可能通过ROS代谢而调节植株生长发育,而两个因子互作可能发生在质膜上,且互作受盐胁迫影响。
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