论文部分内容阅读
脓毒症是一种对感染的全身反应失调的疾病,脓毒症的特征是宿主对感染的全身反应失衡。当先天免疫系统细胞上的模式识别受体（包括Toll样受体）识别出与微生物病原体相关的高度保守的分子模式时,就会发生针对感染的免疫激活的途径。在真核生物中,Pre-m RNA的剪接是转录过程中的关键调控过程,该过程通过剪接体去除Pre-m RNA中的内含子,并将各个外显子连接起来以形成成熟的m RNA。选择性剪接受到RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）的调控,这些RNA结合蛋白与Pre-m RNA相结合并通过与剪接机制来调控Pre-m RNA的选择性剪接。TRA2α和TRA2β,这两个RNA结合蛋白,是Transformer2（TRA2）基因编码的两个旁系同源基因。GIT2,G蛋白偶联受体激酶相互作用因子2,在单核细胞和巨噬细胞中高度表达,参与LPS诱导的NF-k B信号通路激活。不同Git2选择性剪接异构体调控NFκB信号通路可能存在差异。因此,研究Git2的选择性剪接异构体的表达、功能以及调控机制对于脓毒症的研究具有重要的意义。本课题旨在研究Git2的两个剪接异构体（将其命名为Git2-L和Git2-S）所受到的调控机制,以及Git2-L和Git2-S在炎症过程中所起到的作用。本研究主要从以下三个方面进行研究:第一个方面:对急性炎症模型的小鼠肝脏转录组的高通量测序数据进行分析。首先,每只小鼠按2.5 mg/kg LPS注射入小鼠腹腔,2小时后,建立小鼠急性炎症模型,取其肝脏提取RNA进行高通量测序。其次,对RNA-seq数据进行生物信息学分析,筛选在LPS处理前后发生显著性剪接变化的基因和表达量显著性改变的剪接因子。然后,将这些筛选出来的基因和剪接因子分别通过RT-PCR和q RT-PCR进行验证。经验证发现,在LPS处理后,Git2、Irf7、Rnf31、Spag9这几个与炎症相关的基因的选择性剪接形式均有着明显的表达量的变化;ZC3H13、TRA2α、TRA2β、DDX39B、DBR1、RBFOX2、NUP98这些剪接因子均显著增加。最后,通过对数据的分析与验证结果的分析,我们将对TRA2α和TRA2β这两个剪接因子在调节基因的选择性剪接方面做进一步的研究。第二个方面:TRA2α和TRA2β对于基因的选择性剪接的调节的机制及Git2两种剪接异构体的功能研究。首先,分离经LPS处理后小鼠的肝脏实质细胞和非实质细胞,通过q RT-PCR检测出在肝脏非实质细胞中TRA2α,TRA2β显著增加而在肝脏实质细胞中则没有明显的变化。而且分离的小鼠原代腹腔巨噬细胞经LPS处理后,发现TRA2α和TRA2β也显著地增加。其次,构建TRA2α和TRA2β的真核表达质粒,将其分别在小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠巨噬细胞系RAW264.7中过表达,使用q RT-PCR和Western blot验证其过表达的结果。在原代巨噬细胞和细胞系中TRA2α、TRA2β的过表达后,能以剂量依赖性的方式增加炎性细胞因子的表达量。然后,通过RT-PCR证实TRA2α和TRA2β在原代腹腔巨噬细胞中过表达,能以剂量依赖性地调节Spag9剪接异构体的变化。在巨噬细胞系RAW264.7中,其能够调节Arid5a和Git2这两个基因的剪接异构体的变化。接着,通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）实验,发现Git2与TRA2α和TRA2β蛋白有结合。最后,构建Git2两种选择性剪接异构体Git2-L和Git2-S的真核表达质粒,在小鼠巨噬细胞系RAW264.7中过表达并用LPS进行刺激,经q RT-PCR和Western blot实验发现Git2-L有着抑制炎症的作用而Git2-S却有着促炎的作用,随后pp65和p65表达的Western blot实验也验证了这一结果。第三个方面:对于脓毒症患者和正常人的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中TRA2α和TRA2β以及炎性因子表达量的检测。收集脓毒症患者和正常人的血液,分离出PBMC并提取其RNA。经q RT-PCR证实,相对于正常人,脓毒症患者的TRA2α和TRA2β的表达量均显著性增加,促炎性细胞因子如IL1β、TNFα、IL6的表达量也都显著性地增加。综上所述,TRA2α和TRA2β在小鼠腹腔巨噬细胞,巨噬细胞系RAW264.7经LPS刺激和脓毒症患者的外周血单个核细胞中均有显著增加。Git2的两种选择性剪接异构体Git2-L和Git2-S分别有着抑制炎症和促进炎症的作用。TRA2α和TRA2β可以通过调节Git2的这两种选择性剪接异构体来参与炎症的反应过程。因此,TRA2α和TRA2β可以通过调控Git2这个基因的选择性剪接的方式来控制脓毒症的发生发展,这为脓毒症的治疗提供一个新的思路。