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真核生物细胞中有两种翻译起始模式。绝大多数真核m RNA通过帽依赖型模式启动相应蛋白质的合成。在这种机制中,帽结构与真核翻译起始因子4E(e IF4E)相互作用对于募集其他翻译起始因子(e IFs)结合与m RNA的5’端起着关键作用。以内部核糖体进入位点(IRES)起始的蛋白质翻译是另一种蛋白质翻译模式,核糖体通过IRES的二级结构直接被募集并结合m RNA,而不需要依赖5’-末端帽结构。IRES通常不于e IFs结合,但能与一类被称为IRES反式作用因子(ITAFs)的蛋白结合。IRES依赖型翻译起始最早在脊髓灰质炎病毒RNA和脑心肌炎病毒(EMCV)RNA中被发现,现在认为某些细胞RNA也通过这种机制进行翻译,特别是在缺氧或细胞应激引发的异常状态下。IRES已经引起基因治疗领域的兴趣,因为通过它能够设计在一个启动子下表达两个基因的双顺反子基因转移载体。与细胞内大多数需要5’端帽结构m RNA的翻译不同,IRES介导的翻译不需要帽结构参与。肿瘤抑制因子p53控制细胞周期停滞和凋亡通路,是肿瘤抑制的中心。该通路是通过p53蛋白稳定和转录激活功能活化而引发的,以应答在正常细胞异常但在肿瘤细胞中常见的现象,如癌基因活化和DNA损伤。p53基因在超过50%的肿瘤中发生缺失或突变,导致p53通路被破坏,因此p53基因的缺失或突变可能是肿瘤发展中必不可少的一步。所以,p53通路引起了人们的重视,不仅因为其对肿瘤细胞的重要作用,还因其具有肿瘤治疗的潜力。但由于p53受激活信号(如DNA损伤)和调节蛋白(如p14ARF和mdm2)等多种因素的调控,这也解释了为何在肿瘤细胞中单独过表达外源性p53并不能总是有效地导致细胞周期停滞或细胞凋亡。p14ARF是新近发现的抑癌基因,在多种肿瘤中存在缺失突变。而且p14ARF能够与多种蛋白质相互作用发挥抑癌作用。其中一个被广泛认可的功能是通过活化p53,从而抑制细胞因癌基因活化导致的异常生长。p14ARF能够通过抵消mdm2的抑制作用使p53稳定和活化。另外,p14ARF还具有不依赖p53途径的抑制细胞生长的能力。因此p14ARF也是非常具有潜力的基因治疗靶点。我们构建Adp14和Adp14/p53重组腺病毒,对比Adp14与Adp53联合应用和Adp14/p53单独应用对肿瘤细胞的抑制作用,找出更有效的处理方法。然后我们对比p14ARF对帽依赖型翻译和IRES依赖性翻译的影响。方法:(1)通过Ad Easy TM腺病毒载体系统包装重组腺病毒Adp14和Adp14/p53;(2)MTT法检测人结肠癌细胞DLD-1生存率;(3)实时荧光定量PCR检测p14ARF m RNA和p53 m RNA表达;(3)Western blot检测p14、p53、mdm2表达;(4)多聚核糖体分析检测p53翻译速率;(5)si RNA沉默DLD-1细胞内mdm2;(6)构建携带GFP和IRES-GFP的逆转录病毒,感染人食管癌细胞OE33,建立稳转细胞系OE33-GFP和OE33-IRES-GFP;(7)[35S]甲硫氨酸标记OE33-GFP和OE33-IRES-GFP细胞内GFP,接着免疫共沉淀获得GFP蛋白进行SDS-PAGE和荧光照相。结果:(1)与Adp14和Adp53单处理组相比,Adp14与Adp53联合组DLD-1细胞能生存率降低。但Adp14与Adp53联合组的p53蛋白质含量很低;(2)通过多聚核糖体分析发现Adp14处理的DLD-1细胞p53的翻译速率降低,说明过表达p14ARF能抑制p53翻译。Adp14/p53处理的DLD-1细胞p53又恢复高速翻译状态;(3)通过干扰DLD-1细胞的mdm2基因表达,显示mdm2的缺失不能使p53翻译速率下降,排除了mdm2诱导Adp14/p53组DLD-1细胞内p53翻译速率提高的可能;(4)通过对比Adp14与Adp53联合组、Adp14/p53组发现,p53通过不同方式进行翻译。Adp14与Adp53联合组通过帽依赖型方式翻译,Adp14/p53组通过IRES依赖型方式翻译。DN-MEFs细胞分别被Adp53、Adp14/p53、Adp14与Adp53联合处理,多聚核糖体分析发现Adp14与Adp53联合组p53翻译速率低,而Adp14/p53组翻译速率高。过表达p14ARF时,通过帽依赖型翻译的p53受到抑制,而通过IRES依赖型翻译的p53不受影响;(5)构建OE33-GFP和OE33-IRES-GFP稳转细胞系,通过[35S]甲硫氨酸标记技术检测GFP蛋白合成速率。结果显示通过帽依赖型翻译的GFP蛋白合成受到抑制,与对照组比下降了90%左右,而通过IRES依赖型翻译的GFP蛋白合成仅受到微弱的影响。说明IRES调节的翻译能逃脱p14ARF的翻译抑制,并且这是涉及p14ARF的基因转移的普遍现象。结论:(1)Adp14联合Adp53同Adp14/p53一样能够抑制肿瘤生长,但Adp14/p53的抑制作用更显著。(2)p14ARF能够影响帽依赖型机制进行的蛋白质翻译速率,抑制蛋白质合成;而IRES依赖型蛋白质翻译能克服p14ARF的翻译抑制作用。综上所述,p14ARF不仅是肿瘤抑制蛋白,还具有抑制帽依赖型翻译起始的功能。这表明在高水平p14ARF存在时,将基因置于IRES下游能够保持基因产物的高效翻译,这一发现可能对肿瘤基因治疗策略有重大意义。