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研究背景与目的:人的精子发生过程包括精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂以及精子细胞的变形过程。人睾丸的支持细胞(Sertoli cells)是人生精小管中唯一的体细胞,它不仅参与构成血睾屏障,而且,可以释放出大量的生长因子来维持人精子发生的顺利进行。精子发生是一个非常复杂的过程,受到各种遗传因素、表观遗传因素以及所处微环境的影响。在啮齿动物中,有大量研究表明非编码小RNA(microRNA)对正常精子发生具有重要调控作用,其功能异常可导致精子发生的异常。但是,microRNA在正常人睾丸组织和非梗阻性无精子症的精原细胞、精母细胞以及精子细胞的表达谱差异,以及它对正常人支持细胞中的作用及其机制还未见报道。因此,本学位论文的研究目的有:1)首次大规模比较了梗阻性无精子症(OA)和唯支持细胞综合症(SCOS)患者睾丸组织的支持细胞的microRNA差异表达谱;2)研究了miRNA-133b对人支持细胞中的功能和调控靶标;3)我们对梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症的精原细胞、精母细胞以及精子细胞的大规模差异谱进行了对比、验证和生物信息学分析。方法:第一部分:microRNA在正常人睾丸组织和非梗阻性无精子症的支持细胞差异表达、miRNA-133b对人支持细胞的作用及其机制。首先,利用microRNA芯片以及实时定量PCR筛选和验证梗阻性无精子症和唯支持细胞综合症患者的睾丸组织支持细胞的差异表达microRNA。运用miRNA-133b的特异激动剂和抑制剂、CCK-8方法以及蛋白印迹技术,检测了miRNA-133b其对人支持细胞增殖的影响;采用免疫组织化学技术比较了梗阻性无精子症和唯支持细胞综合症患者睾丸组织中支持细胞的增殖状况。利用生物信息学预测miRNA靶标,并用实时定量PCR、miRNA-133b激动剂和抑制剂以及蛋白印迹技术进一步验证了其靶标;最后,我们利用siRNA技术及CCK-8方法进一步研究了该靶标对支持细胞增殖的功能。第二部分:microRNA在正常人睾丸组织和非梗阻性无精子症的精原细胞、粗线期精母细胞以及圆形精子细胞的表达谱差异。利用两步酶消化、差异贴壁以及STA-PUT梯度沉降方法分选出梗阻性无精子症患者以及非梗阻性无精子症患者睾丸组织的精原细胞、粗线期精母细胞以及圆形精子细胞。将梗阻性无精子症患者和非梗阻性无精子症的各种生殖细胞5人一组混合成一个样本,抽提RNA,经RNA扩增后进行RNA深度测序,随机选取了11种microRNA进行了验证,利用生物信息学预测了这些microRNA的靶标,并利用实时定量PCR进一步验证了其靶标。结果:第一部分:利用两步酶法和差异贴壁的方法分离出人睾丸组织支持细胞,免疫细胞化学显示,所分离的细胞表达GATA4、WT1、SOX9、BMP4、SCF和GDNF等蛋白,表明这些细胞具有人支持细胞的生化表型。microRNA芯片显示,174种microRNA在梗阻性无精子症与唯支持细胞综合症患者支持细胞的表达差异显著,其中,在唯支持细胞综合症患者支持细胞中有88种microRNA表达上调,有86种microRNA表达下调;实时定量PCR验证了microRNA芯片发现的部分差异表达microRNA。miRNA-133b模拟物可以促进人支持细胞的增殖,相反,其抑制剂可以降低人支持细胞的增殖。免疫组织化学显示,在唯支持细胞综合症患者的睾丸组织中有更多的支持细胞处于增殖状态。实时定量PCR以及蛋白印迹表明,GLI3是miRNA-133b的直接靶标;miRNA-133b通过增强细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白D1的表达而促进支持细胞的增殖。RNA干扰技术可降低支持细胞GLI3基因与蛋白表达水平,CCK-8显示下调GLI3的表达可促进人支持细胞的增殖。第二部分:利用两步酶消化、差异贴壁以及STA-PUT方法分离梗阻性无精子症(OA)和非梗阻性无精子症患者(NOA)睾丸组织的精原细胞、粗线期精母细胞以及圆形精子细胞,并对其形态学表型进行了鉴定。提取OA及NOA患者的各级生殖细胞RNA和RNA深度测序显示,在NOA患者的各级生殖细胞中microRNA普遍高表达,而pi RNA低表达。我们着重比较了OA与NOA患者的精原细胞的microRNA表达谱差异。对比OA与NOA精原细胞,76种miRNA在OA精原细胞中表达,而在NOA精原细胞不表达,88种miRNA在OA的精原细胞中表达高于NOA的精原细胞;91种miRNA在NOA的精原细胞中表达,而在OA的精原细胞不表达,308种miRNA在NOA的精原细胞中表达高于OA的精原细胞。我们随机选取了11种microRNA进行了验证,并利用生物信息学预测了其靶标,实时定量PCR结果验证了差异表达miRNA及其靶标在OA和NOA精原细胞的表达差异。结论:本学位论文研究通过大规模比较梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症患者的支持细胞和各级生殖细胞的表达谱,发现了重要的差异表达microRNA,并对其进行了生物信息学分析,预测以及验证了靶标。结果表明这些microRNA对人类精子发生及异常有重要的调控作用。同时,我们发现miRNA-133b通过调控转录因子GLI3促进人支持细胞的增殖。本研究为人类精子发生及其异常的机制提供了新的表观遗传机理,并为男性不育的诊断与治疗提供新的靶点。