论文部分内容阅读
目的:构建出具有转染后能表达活性的骨形态形成蛋白-7的重组腺病毒。将已构建好的重组腺病毒直接导入肾纤维化大鼠肾脏,观察其抗肾纤维化的作用,为腺病毒介导BMP-7的进一步基因治疗提供可靠的实验基础;同时对照研究三七总皂甙对肾间质纤维化和BMP-7的影响与机制。 方法:无菌级雄性SD大鼠64只随机分为四组:(1)假手术组(S):大鼠手术剖腹后仅游离左侧输尿管但不结扎。(2)单侧输尿管梗阻组(U):大鼠行手术剖腹,分离并于肾盂下结扎左侧输尿管。(3)BMP-7治疗组(B):大鼠行手术剖腹,自结扎处以上的输尿管逆行注射包含无菌生理盐水BMP-7病毒的混合液,注射后局部压迫片刻并随即于注射处上方结扎输尿管,在两处结扎之间离断输尿管。(4)三七总皂甙治疗组(P):大鼠行手术剖腹,分离并于肾盂下结扎左侧输尿管,术后每晚给予三七总皂甙(PNS)腹腔注射1次,每只大鼠每次注射100mg/kg。S组、B组和U组同时给予同样剂量的蒸馏水,腹腔注射。造模后第7、14、21、28d每组处死四只大鼠,取左侧肾脏进行病理切片观察,并作指标检测。以免疫组织化学方法检测肾组织中α-SMA蛋白的表达水平,以逆转录-多聚酶链反应技术检测TGF-β1的表达水平。 结果:光镜下观察,HE及Masson染色S组未见异常。HE染色可见U组、B组及P组各时相点大鼠肾脏肾小球均无明显变化。U组术后第7天肾小管扩张明显,上皮细胞变性、水肿、甚至坏死,肾间质大量炎症细胞浸润,间质宽度明显增加,偶见萎缩肾小管;第14天上述病变加重,可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩,小管基底膜不同程度断裂,皮质及外髓萎缩的肾小管较多,间质中大量淋巴单核细胞浸润,纤维化较明显。Masson染色可见U组术后7天肾小管扩张,肾间质宽度增加,胶原纤维增加,染色加深此后,病变逐渐加重。P组与B组平行相比肾小管间质病变程度明显减轻,肾间质相对面积明显减少(P<0.01)。三组间比较均有统计学差异(P<0.01)。免疫组织化学结果显示:与S组相比,U组肾小管间质α-SMA表达及肾小管间质损伤指数明显增高(P<0.05)。UUO术后7天和14天,可见α-SMA阳性的转化分化小管上皮细胞;术后21天,转分化的小管上皮细胞明显减少。与U组相比,B组、P组治疗后肾小管间质α-SMA表达显著减少(P<0.05),并且B组低于P组,(P<0.05)。RT-PCR结果显示:TGF-β1随梗阻时间延长而逐渐增多,第28天,有所下降,但没有统计学意义。在治疗组,B组和P组均比同一识相点U组减少,(P<0.05). 结论: (1)单侧输尿管结扎可以快速建立肾脏细胞转分化和间质纤维化动物模型。 (2)在本课题研究中,将治疗基因BMP-7成功、高效地转移到肾脏的病灶部位,能够明显减轻肾间质纤维化,下调TGF-β1的表达,从而发挥其在单侧输尿管结扎模型中对肾脏的保护作用,延缓和抑制了肾间质纤维化的发展。BMP-7并能有效抑制肾小管间质炎性细胞计数和小管间质损伤。 (3)PNS能有效减轻UUO大鼠肾小管间质的损伤,抑制α-SMA和TGF-β1的表达。在整个实验研究中费用低廉,毒副作用较少。但对于BMP-7影响的研究,将在进一步试验中进行。