大豆是农业生产中一种重要的经济作物,其产量受到大豆疫霉根／茎腐病严重危害。合理利用抗性品种是控制该病害最经济有效的措施。目前已经明确大豆对大豆疫霉抗性包括单Rps基因控制的完全抗性和多基因控制的部分抗性。因此研究大豆抗性基因和疫霉无毒基因在互作过程中的分子机理是解释病害发生机制和开发病害控制措施的根本途径。也是为农业实际生产过程中培育广谱、稳定、高效、持久抗病品种的基础。利用在模式植物(烟草、拟南芥)中过表达病原菌效应分子的方法已经对许多疫霉效应分子的功能进行了分析,但是,对于大豆疫霉无毒基因在寄主中的功能尚没有报导。其中一个关键的原因是在大豆上尚缺乏高效的遗传操作技术体系,农杆菌介导的发状根转化在大豆与病原菌互作过程中的应用已有报导；该技术可以对目的基因进行过表达和沉默操作。因此本研究以疫霉无毒基因Avr1b和大豆GmSGT1为对象,利用农杆菌介导的大豆发状根转化,对Avr1b干扰寄主防卫反应机制和GmSGT1的抗性功能进行了研究。Avr1b作为大豆疫霉中克隆的第一个无毒基因,被证明能够增强大豆疫霉毒力功能,抑制由BAX触发的植物细胞死亡。然而,Avr1b对寄主防卫反应的干扰作用及机制尚不明确。本研究通过在大豆发状根组织中过表达Avr1b,研究了其对寄主防卫反应的干扰。主要结果如下：1. Avr1b促进大豆疫霉对转基因发状根组织的侵染对转基因组织抗性水平的分析表明,过表达Avr1b的根组织在接种后病斑扩展速度显著大于对照。利用qRT-PCR的方法对接种后4个时间点(12h,24h,36h,48h)组织内大豆疫霉相对积累量检测的结果同样表明,过表达Avr1b的组织内疫霉相对生物量在所有时间点均显著高于对照。2. Avr1b加剧大豆与疫霉亲和互作晚期寄主细胞死亡对疫霉游动孢子侵染过程中发状根组织电解质渗漏水平的检测表明,在侵染后期(36 h,48 h)过表达Avr1b根组织电导率显著大于对照水平。说明过表达Avr1b组织细胞电解质渗漏严重,细胞结构由于疫霉侵染受到严重损害。通过对侵染后期(48h)组织死体自发黄色荧光信号进行检测,发现过表达Avr1b根组织几乎看不到绿色荧光信号,说明组织死亡程度严重。3. Avr1b抑制大豆基础防卫反应利用苯胺蓝和DAB染色的方法对疫霉侵染过程中转基因组织胼胝质沉积和H2O2积累检测的结果显示,Avr1b能够强烈地抑制寄主组织胼胝质沉积和H2O2积累。在过表达Avr1b的根中,胼胝质的沉积不到对照水平的20%；并且用DAB染色的方法检测不到氧迸发现象的发生,H2O2积累水平始终维持在较低水平。4. Avrlb在寄主组织中无明确的亚细胞定位我们分别在烟草叶片和大豆发状根中检测了Avrlb的亚细胞定位情况,二者的结果均表明,Avr1b在细胞膜和细胞核内均有分布。下一步的工作为继续研究其定位和其毒力功能的关系。5. Avr1b对寄主基因转录水平的干扰利用DGE技术分别对过表达Avr1b和GFP对照组织进行了测序,二者数据库的Pearson相关系数为0.945,说明过表达Avr1b并没有严重的影响寄主的基因转录。通过分析共发现了355个显著差异基因,其中143个上调,212个下调。变化倍数(log2 ratio)在-10.5～11.5范围之内,并且超过90%(93.67%)的基因上调或下调倍数(|log2Ratio|)在0～5.0之间。为了探明Avr1b干扰的主要信号途径,我们发现了18个变化倍数|log2Ratio|≥5,并且在其它物种中具有功能注释的候选基因。其同源基因编码蛋白主要涉及：转录因子、过氧化物酶、磷酸化酶、焦磷酸化酶等。进一步对这18个候选基因进行Pathway途径分析,得到4个具有Pathway注释的候选基因,分别注释到苯丙氨酸代谢途径(ko00360)和核糖体途径(ko03010)。其中2个编码过氧化物酶(Gma#S53087018, Gma#S39318532),1个编码单胺氧化酶(Gma#S 19075998),另外一个编码60s核糖体蛋白(Gma#S23062251).推测在大豆发状根组织中异源表达Avr1b主要干扰了转基因组织中活性氧信号通路。SGT1蛋白在许多植物中都是抗病信号途径的关键组分。本文对GmSGT1在大豆与疫霉互作过程中的功能进行了研究,主要结果如下：1. GmSGT1在大豆与疫霉互作过程中诱导表达通过同源比对,在大豆中共存在5个GmSGT1候选基因,根据进化关系划分为3类。转录分析表明所有基因在4个具有不同抗病水平的大豆品种中均受疫霉侵染诱导上调表达。推测其可能参与大豆与疫霉互作过程。2. GmSGT1在不同Rps基因调节的抗病反应中功能存在分化在大豆子叶中沉默GmSGT1影响含有Rps1a,Rps1c,Rps1d,Rps1k和Rps8抗病基因位点的大豆抗性,而在含有Rps2和Rps3a基因位点的品种中其抗性不受影响。推测在大豆与疫霉的非亲和互作过程中不同R蛋白调节的信号通路存在分化。3.GmSGT1参与调控大豆对疫霉部分抗性,并且在烟草中功能保守在Williams(rps)中沉默GmSGT1导致对疫霉抗性降低,而过表达GmSGT1-1使转基因组织对疫霉抗性显著增强,进一步的结果表明,过表达GmSGT1-1抑制侵染过程中疫霉菌丝在组织细胞间的扩展,加速寄主组织H2O2积累。另外,在烟草叶片中过表达GmSGT1-1能够增强其对辣椒疫霉的抗性。4.GmSGT1-1激活转基因组织JA信号通路,抑制寄主H2O2清除和SA信号通路通过对H2O2合成、清除,SA和JA信号通路相关基因在转基因与对照组织中侵染前后(24 h)表达差异进行分析,结果表明,在接种之前GmSGT1-1没有干扰这些抗性相关基因的表达水平。接种后,与H2O2合成相关的NADPHOX表达水平与对照相比也没有表现出显著差异,但与清除相关的APX1、CAT1诱导水平显著低于对照；同时SA信号通路标志基因NPR1、PR1a、PR5诱导表达水平也显著低于对照水平；而JA信号转导途径标志基因ERF的诱导表达水平则显著高于对照。推测GmSGT1-1过表达使植物体内H2O2清除能力降低,从而造成H2O2在体内的持续积累；同时GmSGT1-1激活JA信号通路,而抑制SA防卫信号通路。