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2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)不仅可以感染仔猪,也可以感染人类,是危害养猪业及其从业相关人员的重要的人畜共患病病原体。猪链球菌病已经出现40多年了,但是到目前为止仍不断有新的感染病例出现,且在东南亚等国,该疾病的流行趋势没有减弱。中国曾经爆发了两次大规模的人感染猪链球菌的群体公共卫生事件,且多数患者因细菌感染而引发了中毒性休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome,STSS),从而无法扭转病程,最终62.7%~81.3%的患者死亡。本课题组密切关注这两次突发感染事件,从中分离到了导致这两次疾病流行的高致病性2型猪链球菌,S.suis 98HAH12和S.suis 05ZYH33,并对其进行了详细的生物学特性研究和基因组学特性分析。其中,我们确定高致病性2型猪链球菌所特有的一个大小约为89 kb的致病岛(89K pathogenicity island,89K PAI),是导致这两次疾病流行致死率较高的主要原因,且89K PAI上含有毒力因子(virulence-associated factor,VAF)、二元信号转导系统(two-component signal transduction system,TCSTS)和四型分泌系统(type IV secretion system,T4SS)等与细菌致病性密切相关的基因元件。已鉴定出的猪链球菌的毒力因子有20多个,其中最主要的是荚膜多糖(capsular polysaccharides,CPS)和猪链球菌溶血素(suilysin,SLY),CPS不仅可以为细菌提供保护屏障,还参与细菌对宿主细胞的抗吞噬能力;SLY可以增加细菌密度,促进细菌引发宿主炎症反应。其他毒力因子也参与到细菌与宿主的相互作用和促进细菌透过宿主的血脑屏障等。但是,猪链球菌毒力的来源及分化尚不清楚,寻找有效的预防手段是防治猪链球菌病的长远目标。因此本课题以从流行区猪群中分离到的一株不致病的2型猪链球菌为研究基础,通过对其进行生物学特性鉴定、全基因组测序和比较基因组学分析,探讨猪链球菌各菌株之间毒力演化和基因组重排的方式,探索可以预防该疾病的疫苗。主要研究内容和实验结果如下:1.2型猪链球菌05HAS68生物学特性的鉴定:分别对细菌进行培养观察和革兰染色,用分光光度计法测定细菌的溶血活性,列举活菌数目测定细菌的全血存活能力。用流式细胞仪测定细菌对Hep-2细胞的粘附能力,用梅里埃生化检测卡鉴定细菌的生化反应类型。通过以上实验我们确定S.suis 05HAS68与高致病性菌株S.suis 05ZYH33相比,是一株具有较高粘附能力但溶血活性较差的血清2型猪链球菌。进一步利用16S r RNA基因分型和多位点序列分型,证明该菌株属于猪链球菌属,ST28型。2.2型猪链球菌05HAS68全基因组测序及全基因组注释:利用二代测序技术Ion torrent PGM测序仪,分别构建待测基因组的测序文库,其中Mate-pair 4 kb库和shotgun小片段随机库分别达到127×和114×的测序覆盖度。采用Newbler v2.8和CLC Genomics Workbench对测序reads进行拼接后得到S.suis 05HAS68的全基因组序列长度为2,176,073 bp。通过RAST在线注释和比对BLAST、COG、KEGG数据库对S.suis05HAS68进行全基因组注释。利用DNAStar软件包、CGView Server、t RNAScan-SE 1.21和RNAmmer 1.2,分析S.suis 05HAS68基因组的一般特性。注释及分析结果显示,S.suis 05HAS68基因组的GC含量为41.2%,共编码2009个基因,另外还编码56个t RNA基因和12个r RNA基因。3.2型猪链球菌05HAS68与有毒株的比较基因组学分析:采用比对毒力因子数据库和BLASTp比对的方法,鉴定S.suis 05HAS68基因组上存在的VAF和TCSTS。通过Island Viewer、CRISPRfinder和Prophage Finder鉴定S.suis 05HAS68基因组上可能的基因组岛、CRISPR结构和前噬菌体结构。利用ACT和Mauve软件分析S.suis05HAS68与其他猪链球菌基因组大规模重排的方式和规律。我们发现S.suis 05HAS68与S.suis 05ZYH33和S.suis 98HAH12共有1751个基因,但是S.suis 05HAS68特有253个基因。其中包括1个CRISPR结构、4个前噬菌体结构和1个113K代谢岛(半乳糖代谢途径和岩藻糖代谢途径)。S.suis 05HAS68基因组中缺少重要的VAF,例如SLY、MRP、EPF和毒力相关蛋白E等,Sal K/Sal R、Nis K/Nis R、Vir R/Vir S和Rev S等毒力相关的TCSTS在S.suis 05HAS68基因组中也是缺失的。S.suis 05HAS68基因组与其他猪链球菌基因组之间存在由转座酶和前噬菌体介导的大规模基因组重排,且重排围绕基因组的复制轴(ori/ter axis)呈“X形”。4.89K PAI在S.suis各菌株中的分布情况及S.suis的系统发生分析:比对89K PAI序列在猪链球菌以及其他链球菌中的分布情况。在猪链球菌P1/7、A7、GZ1、S735、ST1和ST3菌株中没有比对到89K PAI的同源序列,在猪链球菌SC84和BM407中比对到了绝大部分的89K PAI同源序列,其他猪链球菌中则比对到了一部分89K PAI同源片段,另外在无乳链球菌和肺炎链球菌中也比对到了部分89K PAI的同源序列。综合评价用rpo B、16S r RNA、ITS(internal transcribed spacer)和core gene构建的系统发生树,可以看出S.suis 05HAS68在进化关系上与高致病性2型猪链球菌相距较远。5.2型猪链球菌05HAS68的毒力鉴定及免疫保护初探讨:用同等剂量(1×108 CFU)的S.suis 05HAS68、高致病性菌株05ZYH33和98HAH12分别攻击仔猪。攻毒实验证明,S.suis 05HAS68对动物不具有致死性。分别用无毒株05HAS68和基因敲除改造的无毒株Δsal KR免疫仔猪2次后,再用高致病性菌株05ZYH33或98HAH12进行攻击,观察无毒株05HAS68对仔猪是否具有免疫保护作用。实验结果显示,事先用无毒株05HAS68免疫的动物可免受高致病性菌株的攻击,但是用基因敲除改造的无毒株Δsal KR免疫的仔猪,不能抵抗高致病性菌株05ZYH33的攻击,初步说明S.suis05HAS68对仔猪具有免疫保护效果。综上所述,本研究成功的鉴定了一株无毒的2型猪链球菌05HAS68,并对其进行全基因组测序和比较基因组学分析。研究发现,S.suis 05HAS68与高致病性猪链球菌之间存在较大的毒力差异,且基因组间存在大规模重排,可能是由转座酶和/或前噬菌体介导的。该无毒株有望成为预防猪链球菌病的疫苗候选株。