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心血管疾病已经成为威胁人类健康的的主要疾病,其可以引起较高的致死率和致残率,而高血脂是心血管疾病的危险因素,因此寻找可以防治高脂血症的药物很关键。高脂血症是指体内血清总胆固醇(total cholesterol, TC)水平异常升高、甘油三酯(triglyceride, TG)水平异常升高、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)水平异常升高和/或高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平异常低下。目前市场上降脂药物价格昂贵而且伴有严重的不良反应,因此越来越多的研究致力于从天然植物中寻找有效的降脂活性成分。黄连在中国传统主要用于感染性疾病的预防和治疗,生物碱类成分是其主要的活性成分,主要包括小檗碱、巴马汀、黄连碱和表小檗碱。其中,小檗碱的降脂活性已经在动物及临床试验中得到证实。本课题组前期研结果表明黄连主要生物碱在昆明鼠中经口途径的半数致死量(median lethal dose, LD50)由高到低的顺序为：巴马汀(1533mg/kg)>表小檗碱(1360mg/kg)>黄连碱(852mg/kg)>小檗碱(712mg/kg),由此可见巴马汀的安全性比其他主要的黄连生物碱要高,是否巴马汀像小檗碱一样具有降脂活性仍是未知。为了弄清巴马汀的降脂活性及作用机理,为巴马汀进一步综合开发利用做好铺垫,本课题对黄连的根茎和须根中的主要生物碱类成分的组成及含量进行了比较,成功从黄连根茎中分离制备得到了纯度较高的巴马汀单体,并通过高脂血症金黄地鼠模型对巴马汀的降脂活性及作用机制进行了研究,实验方法与结果如下：1.黄连根茎和须根中生物碱类成分组成及含量的比较通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)同时比较了黄连根茎及须根中主要生物碱类成分的分布情况。实验结果表明黄连根茎及须根中均含有小檗碱、巴马汀、黄连碱和表小檗碱,但是生物碱含量有所差异。其中,黄连根茎部位小檗碱含量为5.61%、巴马汀含量为1.48%、黄连碱含量为1.74%、表小檗碱含量为0.72%。在黄连的须根部位,小檗碱含量为1.20%、巴马汀含量为0.08%、黄连碱含量为1.28%、表小檗碱含量为0.53%。由此看出,虽然黄连根茎及须根部位均含有生物碱类成分,但是就总生物碱含量而言,黄连根茎部位的总生物碱含量大于黄连须根部位总生物碱含量。就单体分布情况而言,黄连根茎以小檗碱的含量最高,以表小檗碱的含量最低；黄连须根以黄连碱的含量最高,以巴马汀的含量最低。2.黄连根茎中巴马汀单体的制备取经过干燥的黄连根茎10kg进行粉碎后,用70%乙醇于室温下冷浸提取三次,每次提取24h,固液比为1：10。将连续三次冷浸提取得到的黄连生物碱提取液合并、通过减压蒸馏回收乙醇,即可得到黄连醇提物,经过真空干燥后称重,并计算黄连生物醇提物提取得率。采用高速逆流色谱法(high-speed counter-current chromatography, HSCCC)从黄连醇提物中分离出巴马汀成分。具体的高速逆流色谱条件为：采用高速逆流色谱仪,以氯仿-甲醇-0.2 mol/L盐酸(4：1.5：2,v/v/v)为溶剂体系,流动相的流速为2.0mL/min,检测波长为254nm,主机转速为800r/min,恒温循环温度为25℃。在该高速逆流色谱条件下将制备得到的黄连醇提物浸膏进行巴马汀单体的分离。高速逆流色谱分离的流出液分部收集,6min/管。用薄层色谱(thin layer chromatography, TLC)对收集的流分进行检测,采用的展开系统为：环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3:3.5:1:1.5:0.5:1, v/v/v/v/v/v),检视波长为345nm。将含巴马汀色谱峰的流出液合并、浓缩、真空干燥至干,即得到巴马汀粗提物。将制备得到的巴马汀粗提物上葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱进一步分离纯化得到巴马汀单体,并计算巴马汀单体的提取得率。采用质谱法测定巴马汀的分子量,采用光谱法对巴马汀进行了结构鉴定,通过HPLC检测了巴马汀单体的纯度。实验结果表明通过乙醇回流得到的黄连醇提物提取得率为36%,通过高速逆流色谱法及葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱联合制备得到的巴马汀单体产率为4%。通过HPLC检测制备得到的巴马汀单体的纯度,结果表明从黄连根茎中制备得到的巴马汀单体纯度可以达95%。3.巴马汀体内降脂活性的研究通过金黄地鼠连续4周自由采食高脂饲料建立高脂血症模型,并通过测定血脂水平判定所建立的高脂血症模型成功以否。成功建立高脂血症动物模型后,将高脂血症金黄地鼠随机分为模型组、巴马汀低剂量组(23.35mg/kg)、巴马汀中剂量组(46.70mg/kg)、巴马汀高剂量组(70.05mg/kg)、辛伐他汀阳性对照组(1.2mg/kg)。各个试验组中金黄地鼠均为10只。另外取10只采食基础饲料的金黄地鼠作为正常组。通过灌胃途径给药,干预治疗时间为4周。于试验末期,连续收集各组金黄地鼠于72h内排泄的粪便,用于总胆汁酸(total bile acids, TBA)及TC的含量分析；采血用于血脂测定；收集肝脏和回肠用于降脂机制的研究。实验结果表明,金黄地鼠连续采食高脂饲料4周可引起血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平显著升高(P<0.01),表明高脂血症金黄地鼠模型造模成功。与正常组比,模型组的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平分别显著升高2.4倍、4.3倍、2.2倍和2.0倍。巴马汀在低剂量(23.35mg/kg)、中剂量(46.70mg/kg)和高剂量(70.05mg/kg)均可显著降低高脂血症金黄地鼠异常升高的TC、TG和LDL-C的水平(P<0.01或0.05),但是均对血清中HDL-C水平无显著影响(P>0.05)。阳性对照药物辛伐他汀同样也可显著降低高脂血症金黄地鼠血清中TC、TG和LDL-C的水平(P<0.01),但是对血清中HDL-C水平无显著影响(P>0.05)与模型组相比,高剂量巴马汀组(70.05mg/kg)中金黄地鼠血清的TC、TG、LDL-C水平分别降低41%、64%和48%。通过测定粪便中TC和TBA水平,结果表明高脂饲料可以显著提高粪便中TC和TBA的排泄(P<0.01)。与正常组比,模型组金黄地鼠粪便中TC和TBA的排泄量分别提高了66%和58%。巴马汀进行干预治疗时,其在低剂量(23.35mg/kg)、中剂量(46.70mg/kg)和高剂量(70.05mg/kg)时均可进一步显著提高金黄地鼠粪便中TC和TBA的排泄(P<0.01或0.05)。与模型组比,高剂量巴马汀组(70.05mg/kg)中金黄地鼠粪便TC和TBA的排泄量分别提高41%和70%,而阳性对照药物辛伐他汀对高脂血症金黄地鼠粪便中TC和TBA的排泄无显著影响(P>0.05)。由此可见,巴马汀可显著降低高脂血症金黄地鼠异常升高的血脂水平,同时还可促进金黄地鼠粪便中TC和TBA的排泄。4.巴马汀体内降脂机制的研究通过检测高脂血症金黄地鼠肝脏部位羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase, HMGR)、低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor, LDLR)和胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7a-hydroxylase, CYP7A1)的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)及蛋白表达以及回肠部位顶端Na+/胆汁酸转运体(apical Na+-bile acid transporter, ASBT)的mRNA及蛋白表达来探索巴马汀的降脂机制。实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测结果表明：与正常组比,模型组高脂血症金黄地鼠肝脏部位HMGR mRNA的表达无显著性变化(P>0.05)；肝脏部位LDLR mRNA的表达显著降低了70%(P<0.01),肝脏部位CYP7A1 mRNA的表达显著降低了67%(P<0.01)；回肠部位ASBT mRNA的表达显著上调了近2倍(P<0.01)。通过巴马汀干预治疗4周后,与模型组比,巴马汀在低剂量(23.35mg/kg)、中剂量(46.70mg/kg)和高剂量(70.05mg/kg)时对高脂血症金黄地鼠肝脏部位HMGR mRNA表达无显著影响(P>0.05)；巴马汀在低剂量(23.35mg/kg)、中剂量(46.70mg/kg)和高剂量(70.05mg/kg)寸均可显著上调高脂血症金黄地鼠肝脏部位LDLR mRNA的表达(P<0.01或0.05),巴马汀为高剂量(70.05mg/kg)时,可上调LDLR mRNA表达达到2.3倍；巴马汀在低剂量(23.35mg/kg)、中剂量(46.70mg/kg)和高剂量(70.05mg/kg)时均可显著上调高脂血症金黄地鼠肝脏部位CYP7A1 mRNA的表达(P<0.01或0.05),巴马汀为高剂量(70.05mg/kg)时,可上调CYP7A1 mRNA表达达到2.0倍；巴马汀为中剂量(46.70mg/kg)和高剂量(70.05mg/kg)时可显著抑制高脂血症金黄地鼠回肠部位ASBT mRNA的表达(P<0.01或0.05),巴马汀为高剂量(70.05mg/kg)时可显著抑制ASBT mRNA表达,抑制率达44%。QRT-PCR结果还表明与模型组比,阳性对照药物辛伐他汀可显著抑制高脂血症金黄地鼠肝脏部位HMGR mRNA的表达(P<0.01),抑制率达到55%,此外,辛伐他汀也可以显著上调金黄地鼠肝脏部位LDLR mRNA的表达达到2.0倍(P<0.01)。辛伐他汀对高脂血症金黄地鼠肝脏部位CYP7A1 mRNA及回肠部位ASBT mRNA表达均无显著影响(P>0.05)。蛋白免疫印迹法(western blot)检测结果表明：与正常组比,模型组的高脂血症金黄地鼠肝脏部位HMGR的蛋白表达无显著性差异(P>0.05)；肝脏部位LDLR的蛋白表达显著降低了54%(P<0.01),肝脏部位CYP7A1的蛋白表达显著降低了50%(P<0.01)；回肠部位ASBT的蛋白表达显著上调了近2.4倍(P<0.01)。通过巴马汀干预治疗4周后,发现巴马汀在低剂量(23.35mg/kg)、中剂量(46.70mg/kg)和高剂量(70.05mg/kg)时对高脂血症金黄地鼠肝脏部位HMGR蛋白表达均无显著影响(P>0.05)；巴马汀在低剂量(23.35mg/kg)、中剂量(46.70mg/kg)和高剂量(70.05mg/kg)时均可显著上调高脂血症金黄地鼠肝脏部位LDLR蛋白的表达(P<0.01或0.05),巴马汀为高剂量(70.05mg/kg)时,可上调LDLR蛋白表达达到1.7倍；巴马汀在低剂量(23.35mg/kg)、中剂量(46.70mg/kg)和高剂量(70.05mg/kg)时均可显著上调高脂血症金黄地鼠肝脏部位CYP7A1蛋白的表达(P<0.01或0.05),巴马汀为高剂量(70.05mg/kg)时,可上调CYP7A1蛋白表达达到1.8倍；巴马汀为中剂量(46.70mg/kg)、高剂量(70.05mg/kg)时均可显著抑制高脂血症金黄地鼠回肠部位ASBT蛋白的表达(P<0.01),巴马汀为高剂量(70.05mg/kg)时可显著抑制ASBT蛋白表达,抑制率达49%。Western blot结果还表明阳性对照药物辛伐他汀可显著抑制高脂血症金黄地鼠肝脏部位HMGR蛋白的表达,抑制率达到33%,此外,辛伐他汀也可以上调高脂血症金黄地鼠肝脏部位LDLR蛋白的表达达到1.5倍,尚未发现辛伐他汀对高脂血症金黄地鼠肝脏部位CYP7A1蛋白表达及回肠部位ASBT蛋白表达的影响。